Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung des Versuchsaufbaus für eine Analyse der Bewertung der DNA-Integrität in Stammzellen vor Stammzelltransplantation.
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Methodenartikel
Beurteilung Stem Cell DNA-Integrität für kardiale Zelltherapie
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Stiel und Stamm-abgeleitete Zellen haben immenses Potential als regenerative Therapie für verschiedene degenerative Krankheiten. DNA ist das Lagerhaus genetischer Daten in allen Zellen, einschließlich Stammzellen, und seine Integrität ist grundlegend für seine Regenerationsfähigkeit. Stammzellen werden schnelle Ausbreitung in Labors, die notwendigen Zahlen für die Transplantation zu erreichen. Beschleunigte Zellwachstum führt zum Verlust der DNA-Integrität durch angesammelte Stoffwechselprodukte wie reaktive Sauerstoff, Carbonyl und Alkylantien Agenten. Transplantation dieser Zellen führt zu schlechten Engraftment und Regeneration der sich verschlechternden Orgel. Darüber hinaus Umpflanzen DNA beschädigt Zellen führt zu Mutationen, DNA-Instabilität, zelluläre Seneszenz und möglicherweise lebensbedrohliche Krankheiten wie Krebs. Daher ist eine unmittelbare Notwendigkeit für eine Qualitätskontrollmethode, um die Zelle Eignung für Transplantationen zu bewerten. Hier bieten wir detaillierte Protokolle für die Beurteilung der DNA-Integrität der Stammzellen vor Stammzelltransplantation.
Einleitung
Experimentelle und klinische Beweise zeigt, dass Zelltransplantation gemäßigt linken Ventrikel kontraktilen Ermangelung Herzen1,2,3,4,5 verbessern können ,6,7,8,9. Die jüngsten Fortschritte haben eröffnet weitere attraktive Möglichkeiten für kardiovaskuläre Regeneration; Dazu gehören die erzwungene Expression Neuprogrammierung Faktoren in somatischen Zellen induzieren ....
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Protokoll
(1) Comet Assay
-
Reagenz-Vorbereitung
- Für niedrige Schmelzpunkt Agarose 500 mg niedrig schmelzende Agarose in 100 mL DNA - Platz / RNA-freies Wasser. Erhitzen Sie die Flasche in der Mikrowelle, bis die Agarose auflöst. Stellen Sie die Flasche in einem 37 ° C Wasserbad bis benötigt.
Hinweis: Weiter lesen, finden Sie unter Azqueta Et Al., die die Wirkungen von Agarose-Konzentration auf die DNA-Abbau-Zeit und mehrere Elektrophorese Faktoren23untersucht. - Verdünnen Sie SYBR grün DNA-Farbstoff in Tris-EDTA (TE)-Puffer im Verhältnis 1: 10.000, 1 x Lager Farbstofflösung arbeiten zu erh....
- Für niedrige Schmelzpunkt Agarose 500 mg niedrig schmelzende Agarose in 100 mL DNA - Platz / RNA-freies Wasser. Erhitzen Sie die Flasche in der Mikrowelle, bis die Agarose auflöst. Stellen Sie die Flasche in einem 37 ° C Wasserbad bis benötigt.
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Ergebnisse
Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gezüchtet wurden, und DNA-Schäden und der Schweif Moment, die als Maß für die DNA-Integrität verwendet wurden, wurden von Comet Assay untersucht. iPS-Zellen wurden in niedrigen Schmelzpunkt Agarose eingebettet und auf einen Objektträger gelegt. Die Zellen wurden, dann mit Lyse Puffer, gefolgt von einer alkalischen Lösung, supercoiled DNA erhalten behandelt. Ausgedehnt wurden electrophoresed und Kometen wurden durch DNA-Farbstoff (
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Diskussion
DNA-Integrität schildert Zelle Integrität. Zellen mit beschädigter DNA sind häufig in Stress und schließlich ihre Integrität zu verlieren. Die Integrität der Stiel und Stamm-abgeleitete Zellen, die zum Zweck der Transplantation wird propagiert werden ist für die Zellen ihre gewünschte Funktion ausführen. Transplantation von Zellen mit beschädigter DNA führt zu einer schlechten Engraftment Rate und Leistung der Zelle8,20. Daher ist die Untersuchung der DNA-Integri.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch nationale Herz-, Lungen- und Blut-Institut Stipendien RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 und UO1-HL-134764 (an J. Zhang) und durch die American Heart Association wissenschaftliche Development Grant 17SDG33670677 (zu R. Kannappan).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-Well-Kammer-Objektträger | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Zellablösungslösung |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories | 711-545-152 (RRID: AB_2313584) | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Kaninchen IgG | Jackson Immuno Research Laboratories | 711-165-152 (RRID:AB_2307443) | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Ergänzung, serumfrei, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel-Wachstumsfaktor reduziert | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histon H2A. X (Ser139) | Antikörper-Zell-Signaltechnologie | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Färbung | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
Referenzen
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
