Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca

Resumen

Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una instalación experimental para el análisis de la evaluación de la integridad del ADN en células antes del trasplante de la célula.

Resumen

Vástago y las células derivadas de células madre tienen enorme potencial como terapia regenerativa para diversas enfermedades degenerativas. El ADN es el almacén de la información genética en todas las células, incluyendo células madre, y su integridad es fundamental para su capacidad regenerativa. Las células madre experimentan rápida propagación en los laboratorios para alcanzar el número necesario para el trasplante. Crecimiento acelerado de células conduce a la pérdida de la integridad del ADN por metabolitos acumulados, tales como reactivo oxígeno carbonilo y agentes alquilantes. Transplante de estas células daría lugar a pobres engraftment y regeneración del órgano del deterioro. Por otra parte, el trasplante las células dañadas DNA conduce a mutaciones, inestabilidad del ADN, senescencia celular y posiblemente, mortales enfermedades como el cáncer. Por lo tanto, hay una necesidad inmediata de un método de control de calidad evaluar la idoneidad de la célula para el trasplante. Aquí, le ofrecemos protocolos paso a paso para la evaluación de la integridad del ADN de células antes del trasplante de la célula.

Introducción

Evidencia clínica y experimental demuestra que el trasplante de la célula moderado puede mejorar el rendimiento contráctil del ventrículo izquierdo de no corazones^{1,2,3,4,5 ,6,7,8,9}. Los avances recientes se han abierto más atractivas oportunidades de regeneración cardiovascular; Estos incluyen la expresión forzada de los factores de reprogramación de células somáticas....

Protocolo

1. ensayo cometa

1. Preparación del reactivo
   1. De agarosa de bajo punto de fusión, 500 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 100 mL de DNA / RNA-libre del agua. Calentar el frasco en el microondas hasta que la agarosa se disuelva. Coloque la botella en un baño de agua de 37 ° C hasta que se necesite.
      Nota: Para mayor información, véase Azqueta et al., quienes estudiaron los efectos de la concentración de agarosa en el momento de desenrollar ADN y varios factores de electroforesis²³.
   2. Diluir el colorante verde de SYBR ADN en tampón Tris-EDTA (TE) en una proporción de 1: 10,000 par....

Resultados

Se cultivaron células madre humanas pluripotentes inducidas, y el daño en el ADN y el momento de la cola, que fueron utilizados como una medida de la integridad del ADN, fueron analizados por el ensayo cometa. las células iPS eran incrustadas en agarosa de bajo punto de fusión y coloca en un portaobjetos de vidrio. Las células, entonces, trataron con tampón de lisis, seguido por una solución alcalina, para la obtención de ADN superenrollado. Nucleoids fue electrophoresed y cometas fueron .......

Discusión

Integridad del ADN retrata la integridad celular. Las células con ADN dañado están con frecuencia en tensión y eventualmente pierden su integridad. La integridad de la madre y las células derivadas de células madre que están propagándose con el fin de trasplante es principal para las células realizar su función deseada. Transplante de células con ADN dañado resultaría en una tasa de pobres engraftment y rendimiento de la celda^8,20. Por lo tanto, examinar la integ.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25% Tripsina	Corning	25200056
portaobjetos de 8 pocillos	Millicell	PEZGS0816
Accutase	Stemcell Technologies	7920	Solución de desprendimiento de células
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-545-152 (RRID: AB_2313584)
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-165-152 (RRID:AB_2307443)
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
Gibco B-27 Suplemento, sin suero,Gibco		17504-044
Factor de crecimiento Matrigel reducido	Corning	354230
mTeSR1	Tecnologías de células madre	85850
FaloidinaA488	Tecnología de vida	A12379
Fosfo-histona H2A. X (Ser139)	Tecnología de señalización de células	2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI	Gibco	11875-093
SYBR  Tinción de gel de ácido nucleico Green I	Sigma-Aldrich	S9430
Triton X-100	Fisher scientific	BP151-100
UltraPure Agarosa de bajo punto de fusión	Invitrogen 16520050
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Antidecoloración

de anticuerpos