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Neuroscience

Impianto cronico di tutto-corticale Electrocorticographic Array nel Marmoset comune

doi: 10.3791/58980 Published: February 1, 2019

Summary

Abbiamo sviluppato una matrice electrocorticographic intero-corticale per il marmoset comune che continuamente copre quasi tutta la superficie laterale della corteccia, dai poli frontale e occipitale pole per il temporale. Questo protocollo descrive una procedura di impianto cronica della matrice nello spazio epidurale del cervello uistitì.

Abstract

Electrocorticography (ECoG) permette il monitoraggio dei potenziali di campo elettrico dalla corteccia cerebrale con alta risoluzione spazio-temporale. Recente sviluppo di elettrodi ECoG sottili, flessibili ha permesso di conduzione delle registrazioni stabile di attività corticale su larga scala. Abbiamo sviluppato una matrice ECoG intero-corticale per il marmoset comune. La matrice continuamente copre quasi l'intera superficie laterale dell'emisfero corticale, dal Polo occipitale per il temporale e frontale polacchi, e cattura tutto-corticale attività neurale in un solo colpo. Questo protocollo descrive una procedura di impianto cronica della matrice nello spazio epidurale del cervello uistitì. Uistitì hanno due vantaggi per quanto riguarda le registrazioni di ECoG, uno dei quali l'organizzazione omologa delle strutture anatomiche in esseri umani ed i macachi, compresi complessi frontali, parietali e temporali. L'altro vantaggio è che il cervello di uistitì è lissencephalic e contiene un gran numero di complessi, che sono più difficili da accedere nei macachi con ECoG, che sono esposti alla superficie del cervello. Queste caratteristiche permettono l'accesso diretto alla maggior parte delle aree corticali sotto la superficie del cervello. Questo sistema offre l'opportunità di indagare elaborazione con risoluzioni elevate a un ordine di millisecondo in tempo e l'ordine di millimetro nello spazio corticale globale delle informazioni.

Introduction

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Cognizione richiede il coordinamento degli insiemi neurali attraverso reti cerebrali diffuse, particolarmente la neocorteccia è ben sviluppato in esseri umani, che crede di essere coinvolti in comportamenti cognitivi superiori. Tuttavia, come la neocorteccia realizza questo comportamento cognitivo è un problema irrisolto nel campo delle neuroscienze. Sviluppo recente degli elettrodi sottili, flessibili electrocorticographic (ECoG) consente la conduzione delle registrazioni stabile da attività corticale su larga scala1. Fujii e colleghi hanno sviluppato un'intero-corticale matrice ECoG per scimmie Macaco2,3. La matrice continuamente copre quasi l'intera corteccia laterale, dal Polo occipitale ai poli temporali e frontali e cattura l'intero-corticale attività neurale in un solo colpo. Abbiamo sviluppato ulteriormente questo sistema per applicazione in marmoset comune4,5, una piccola, nuovo mondo scimmia con manipolabilità genetica6,7. Questo animale ha diversi vantaggi rispetto ad altre specie. Il visivi, uditivi, somatosensoriali, motori e le aree corticali frontali di questa specie sono stati precedentemente mappati e segnalati per avere l'organizzazione omologa di base per le stesse aree in esseri umani ed i macachi8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. i loro cervelli sono lisci e aree corticali più laterali vengono esposti alla superficie della corteccia, che è più difficile da accesso con ECoG nei macachi. Basato su queste caratteristiche, l'uistitì è adatto per gli studi di electrocorticographic. Inoltre, uistitì esibiscono comportamenti sociali e sono state proposte per servire da modello dei comportamenti sociali umani17candidati.

Questo protocollo descrive una procedura di impianto epidurale della matrice ECoG sulla superficie intera laterale della corteccia in un comune uistitì. Esso fornisce un'opportunità per monitorare l'attività corticale su larga scala per le neuroscienze corticale primati, tra cui sensoriali, motorie, dominii cognitivi e sociali più elevati.

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Protocol

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Questo protocollo è stato eseguito su 6 comuni uistitì (4 maschi, 2 femmine; peso corporeo = 320-470 g; età = 14-53 mesi). Tutte le procedure sono state effettuate secondo le indicazioni degli istituti nazionali di salute orientamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico RIKEN (No. H28-2-221(3)). Tutte le procedure chirurgiche sono state effettuate nell'ambito dell'anestesia, e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati come pure loro disagio.

1. preparazione

  1. Ottenere un'immagine strutturale a risonanza magnetica (MRI) di ogni cervello individuale. Questo utilizzerà per identificare le posizioni di elettrodo attraverso la registrazione con un uistitì cervello Atlante e computer tomografia (CT).
  2. Preparazione della matrice ECoG: preparare una matrice personalizzata di ECoG multicanale (Figura 1A). Una matrice di ECoG 96ch è costituito da due lastre con 32 e 64 elettrodi. Per gestire le differenze individuali nella dimensione del cervello, la matrice di ECoG ha un braccio flessibile. Il braccio può coprire il Polo temporale, a seconda della forma di cervello individuale. Posizionare gli elettrodi di riferimento fronte fronte ECoG elettrodi e gli elettrodi di terra rivolte nella stessa direzione.
    1. Assemblare la matrice ECoG con un caso di connettore (Figura 1B) e sigillare le lacune del connettore (Figura 1) con colla acrilica per impedire l'afflusso di liquido durante la chirurgia. Sterilizzare la matrice con ossido di etilene.
  3. Preparare e sterilizzare gli strumenti.
    Nota: Tutti gli strumenti utilizzati sono elencati nella Tabella materiali.

2. l'impianto di matrice ECoG

Nota: Ritirare l'ingestione di cibo e liquidi superiore a 4 h prima della chirurgia. Eseguire tutti i passaggi chirurgici con tecnica asettica, utilizzando strumenti e guanti sterilizzati.

  1. Procedure di pre-impianto
    1. Inducono anestesia nell'uistitì tramite iniezione intramuscolare (i.m.) di ketamina (15 mg/kg) 5 min dopo iniezione i.m. atropina (0,08 mg/kg).
    2. Anestetizzare e mantenere l'anestesia con isoflurano (1-3% diluito con una miscela di ossigeno/protossido di azoto) in base allo stato fisiologico dell'animale, che devono essere continuamente monitorati. Assicurarsi che la frequenza cardiaca è 130-180 BPM e monitorare la temperatura corporea e saturazione di ossigeno del sangue arterioso (SpO2) continuamente per giudicare la condizione dell'animale.
    3. Radere la parte superiore della testa dell'animale con clippers e un dispositivo di rimozione dei capelli. Risciacquare completamente Crema depilazione fuori la pelle con una garza bagnata, o causerà danni alla pelle.
    4. Somministrare un antibiotico (cefovecina; 16 mg/kg s.c.), antipertensivi (furosemide; 2,0 mg/kg i.m.) e antiemorragica (carbazochrome solfonato di sodio idrato; 0,2 mg/kg i.m.).
    5. Metti l'animale su una cornice stereotassica. In questo momento, applicare gelatina di lidocaina 2% per l'orecchio-bar e unguento oftalmico agli occhi per prevenire la secchezza e dolore post-operatorio.
    6. Disinfettare l'area chirurgica con soluzione di iodio e coprirlo con drappi sterilizzati. Applicare gelatina di lidocaina 2% al posto dell'incisione della pelle.
  2. Procedure di impianto
    1. Incidere la pelle circa 4 cm attraverso la linea mediana del cuoio capelluto con un bisturi. Staccare il muscolo temporale dal cranio con un curette fino a quando tutta l'area chirurgica è esposto. Pulire tessuti sulla superficie del cranio e fermare l'emorragia completamente con l'emostasi di pressione e con la cera dell'osso, se necessario. Avvolgere il bordo della pelle e i muscoli con una garza inumidita. Mantenere la garza inumidita durante la chirurgia.
    2. Posizionare il bordo frontale della matrice sul bordo del Polo frontale. Contrassegnare un'area prevista per la craniotomia, fessure e fori sul cranio con una matita sterile. La posizione di craniotomia dipenderà la progettazione della matrice (Figura 2).
    3. Praticare il craniotomy lungo segno 1, come illustrato nella Figura 2. Durante la perforazione dell'osso, soffiare aria verso il bordo di taglio per mantenere una visione chiara per il chirurgo. Quindi, tagliare l'osso tutto intorno mark 2, come il pezzo di osso ancora sarà allegato al dura al centro. Sollevare delicatamente il pezzo da un bordo e staccare il dura con una spatola. Questo processo deve essere condotta lentamente e con attenzione, o esso si strappa facilmente la dura madre.
      1. Rimuovere le punte di osso dal pezzo di osso e avvolgere il pezzo con una garza inumidita, come questo pezzo sarà restituito dopo aver impiantato la matrice.
    4. Eseguire il craniotomy 3 e 4 come mostrato nella Figura 2. Consentono l'inserimento di elettrodi nel orbitofrontal e zone occipital, rispettivamente.
    5. Trapano feritoie sul marchio 5 come illustrato nella Figura 2. Queste fessure permettono l'esame della matrice per assicurarsi che sia correttamente inserito.
    6. La dura madre ora sarà esposti. Lavare la zona con soluzione fisiologica e fermare l'emorragia con pressione emostasi e una spugna di gelatina, se necessario. Il bordo del craniotomy aperto potrebbe essere necessario essere pulito con una Pinza ossivora curette o dell'osso.
    7. Rendere le feritoie (indicazione 6 nella Figura 2) in cui sono collocati gli elettrodi di riferimento. Posizionare gli elettrodi di riferimento nello spazio epidurale presso le aree di sensorimotorie e occipitale controlaterale. La posizione deve essere determinata secondo le specifiche esigenze sperimentali.
    8. Eseguire i fori vite in quattro punti intorno ogni gambo del connettore con una vite di 1,0 mm (croci nella Figura 2). Per evitare danni alla materia dura, inserire una spatola sotto il cranio. Questi fori devono essere ortogonali contro il cranio. Quindi, installare viti PEEK (1.4 x 2.5 mm) come ancoraggi per fissare il connettore al cranio.
    9. Inserire la matrice di ECoG nello spazio epidurale. Uso flathead forcipe per mantenere la matrice.
      Nota: La matrice deve essere inserita senza doversi piegare. Se la matrice è piegata, è possibile creare un apposito spazio inserendo una spatola tra il cranio e dura. Se la flessione è stata causata dalle dimensioni relativamente piccole del cervello, tagliare alcuni degli elettrodi.
    10. Difficoltà gli elettrodi di riferimento e terra con un acrilico dentale. Posizionare gli elettrodi di riferimento nello spazio epidurale e gli elettrodi a terra sulla superficie cranica. Entrambi i contatti dovrebbero affrontare il cranio.
    11. Rimettere il pezzo di osso e fissare il connettore e testa post al cranio con dentale acrilico sulle viti.
    12. Suturare la pelle con nylon 6-0 al fronte e testata posteriore e fissare la pelle ai lati del connettore utilizzando pelle chiusure.
  3. Procedure di post-impianto
    1. Rimuovere l'animale dalla cornice stereotassica. Assicurarsi che l'animale è mantenuto caldo e fornito con ossigeno durante la procedura seguente.
    2. Subito dopo della chirurgia, iniettare l'animale con meloxicam (0,3 mg/kg i.m.) per diminuire il dolore postoperatorio. Amministrare un corticosteroide antinfiammatorio (Desametasone; 2,0 mg/kg i.m.) e l'infusione sottocutanea (soluzione di Ringer lattato; 5,0 mL), tra cui famotidine (0,5 mg/kg) come un gastroprotectant.
      Nota: Un uso concomitante di fans con gli steroidi ha un potenziale per gli effetti collaterali gastrointestinali.
    3. Dopo che l'animale ha recuperato (confermare battito cardiaco e SpO2), rimuovere il monitoraggio dei segni vitali e trasferire l'animale in terapia intensiva per 2-3 giorni.

3. trattamento postoperatorio

Nota: In genere bastano 5 giorni per gli animali recuperare completamente dalla chirurgia.

  1. Per evitare il gonfiamento del cervello, amministrare il desametasone del corticosteroide antinfiammatorio (2,0 mg/kg) due volte al giorno il primo giorno dopo l'intervento chirurgico. Quindi, ridurre la dose di 1,5 mg/kg due volte al giorno sul secondo e terzo giorno e 1 mg/kg due volte al giorno il quarto giorno.
  2. Amministrazione di dolore (meloxicam; orale di 0,1 mg/kg una volta al giorno) e un antiemorragica (carbazochrome sodio solfonato idrato; 0,2 mg/kg i.m.; due volte al giorno) per 5 giorni dopo la chirurgia.
    Nota: Nel nostro caso, 1-2 giorni dopo l'intervento chirurgico, alcuni uistitì (3 su 6) è diventato meno attivo e vomitato. Questo potrebbe essere stato causato da pressione intracranica aumentata a causa di un coagulo di sangue. Quando uistitì presentato questi sintomi, abbiamo riaperto la testa e rimosso il coagulo in anestesia generale (alfaxalone). Se non c'era nessun piegamento della matrice ECoG durante l'impianto, il coagulo di sangue era probabile nello spazio tra la matrice e dove è stato restituito il pezzo di osso. In questo caso, il coagulo di sangue può essere lavato via da esecuzione Salina nello spazio utilizzando un catetere. Questa procedura di solito conduce al recupero nell'animale.
  3. Identificazione delle posizioni di elettrodo
    1. Circa 1 settimana dopo l'intervento chirurgico, eseguire una scansione del computer tomografia (CT) della testa dell'animale.
      Nota: Si tratta di una buona occasione per verificare se i segnali possono essere registrati correttamente. Aprire il case del connettore e rimuovere eventuali coaguli di sangue, se sono presenti.
    2. Allineare il T2-weighted MRI coordinate stereotassiche utilizzando AFNI software18 (https://afni.nimh.nih.gov) (Figura 3A). Allineare l'immagine di CT a immagini di T2-weighted anatomico a risonanza magnetica con AFNI (Figura 3B). Registrare un Atlante del cervello di uistitì di MRI (Figura 3) con AFNI e formiche19.

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Representative Results

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La matrice di ECoG intero-corticale è in grado di catturare contemporaneamente attività neuronale dalla totalità di un emisfero. La figura 4 Mostra esempi di potenziali evocati uditivi (AEPs) da più aree uditive in un uistitì sveglio. ECoG registrazioni sono state condotte in condizioni di ascolto passive. Ogni uistitì è stato esposto a stimoli uditivi, che consisteva di toni puri randomizzati con 20 tipi di frequenza. Quindi, abbiamo calcolato AEPs calcolando ECoGs allineato con esacerbazioni dei toni. Forme d'onda differenti sono state osservate da inferiori e superiori uditive zone, che indica che la risoluzione spaziale del nostro array di ECoG può catturare diversi per l'informatica in diverse aree corticali.

Figure 1
Figura 1: preparazione della matrice ECoG. (A) 32 e 64 ECoG matrici (in basso a destra e sinistra), un caso di connettore (in alto a sinistra) e un front-end per i sistemi di registrazione (in alto a destra). La "G" e "R" di ciascuna matrice indicano grand e riferimento elettrodi, rispettivamente. (B) ECoG assemblati matrice. (C) tutti gli spazi vuoti (rettangoli rossi) dovrebbero essere sigillati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: un esempio del craniotomy. (A), il sottile nero grigio e spesso linee indica contorni della matrice ECoG e la zona prevista del craniotomy, rispettivamente. Le croci corrispondono ai fori di ancoraggio. Il numero cerchiato indica l'ordine di foratura. (B) un esempio CT immagine del craniotomy. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: localizzazione di ogni elettrodo. (A) T2-weighted MRI, CT (B) e (C) elettrodo posizioni sull'Atlante. L'Atlante utilizzato in questo manoscritto è il Woodward versione 3-d basate sui. Hashikawa-Atlante20, che è una mappa di MRI-cytoarchitectual. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: esempi di potenziali evocati uditivi. (A) J. scimmia (B) esempi di AEPs zona uditiva. Gli elettrodi situati in diverse zone uditive Visualizza forme d'onda diverse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

9:00 Avviare i preparativi
10:00 Incidere la pelle
Esposizione del cranio (10 min)
Craniotomia (30 min)
11:00 Iniziare a inserire la matrice
Inserire la matrice (60 min)
12:30 Pelle vicina

Tabella 1: Consigliato corso di tempo della chirurgia.

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Discussion

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Per riuscito impianto, animali dovrebbero essere forniti con una nutrizione adeguata prima e dopo la chirurgia. Breve tempo di funzionamento è anche importante per ottimizzare il recupero dell'animale. Preparazioni dovrebbero essere finiti almeno un giorno prima dell'intervento chirurgico. Per ridurre il tempo di funzionamento, è consigliabile formazione precedente craniotomia con inserimento di matrice dell'elettrodo in animali terminati per altri scopi sperimentali. La tabella 1 Mostra un esempio del corso di tempo per questo protocollo.

Abbiamo modificato il trattamento di routine e post-operatorio di anestesia su un caso per caso. In questo video protocollo, gli animali sono stati anestetizzati e mantenuta utilizzando una miscela di isoflurano e ossigeno erogato attraverso l'intubazione tracheale. Isoflurano può essere sostituito con sevoflurane e l'intubazione tracheale può essere sostituito con una maschera. In altri casi, abbiamo anestetizzato animali con iniezione intramuscolare di una miscela di ketamina e medetomidina. In questo caso, gli animali erano inizialmente sedati con butorfanolo (0,2 mg/kg i.m.), e l'anestesia chirurgica è stata realizzata con una miscela di ketamina (30 mg/kg i.m.) e medetomidina (0,35 mg/kg i.m.).

Perché ECoG registra direttamente le variazioni di campi elettrici, la risoluzione temporale è limitata dal sistema di registrazione. La risoluzione di tempo massimo del nostro sistema di registrazione è di 30 kHz. Solitamente abbiamo provato segnali ad una frequenza di campionamento di 1 kHz e hanno trovato questo per essere sufficiente per l'estrazione di informazioni sensoriali/motore.

Risoluzione spaziale dipende dal design dell'elettrodo. In questo protocollo, ogni contatto con l'elettrodo era 0,8 mm di diametro e aveva una distanza inter-elettrodo di 2,5 mm. Abbiamo osservato diverse forme d'onda da tre elettrodi situati in diverse zone uditive e separate da 2,5 mm (ch18, ch19, ch20 nella Figura 4). Così, la risoluzione spaziale del nostro elettrodi è stimata inferiore a 2,5 mm. In alcuni casi, contatti degli elettrodi si trovavano più strettamente a vicenda. In questi casi, la risoluzione spaziale è stato più preciso.

Abbiamo registrato con successo a lungo termine, un neurone segnali con buona qualità. In un caso, il connettore e acrilico dentale sono stati staccati dal cranio, e l'elettrodo è stato rotti 4 mesi dopo l'intervento chirurgico. Ciò è stata causata dalla crescita di tessuto a causa di sangue essere contenuto tra il cranio e acrilico dentale durante la chirurgia. Un altro marmoset è stata terminata a causa di un requisito sperimentale 5 mesi dopo l'intervento chirurgico. Quattro animali ancora stanno partecipando a esperimenti (1 anno, 7 mesi, 4 mesi, e 4 mesi dopo l'intervento chirurgico, rispettivamente).

ECoG matrici in genere vengono impiantate nello spazio subdurale in esseri umani ed i macachi. Tuttavia, meno invasive attecchimenti epidurale sono più adatti a uistitì, perché sono animali delicati. Il sottile dura questione di uistitì ci ha permesso di monitorare i segnali ad alta frequenza del cervello, anche se la matrice di ECoG è stata impiantata il dura. Uno degli svantaggi dell'impianto epidurale è la difficoltà ad accedere a qualsiasi corteccia all'interno di un solco e la corteccia del midline. Si avvicina queste cortecce richiede incisione della materia dura. Inoltre, poiché le matrici ECoG sono elettrodi di superficie, è difficile specificare la sorgente del segnale in termini di profondità corticale. Al fine di comprendere le informazioni precise di elaborazione nella corteccia, è necessario includere altri metodi, quali elettrodi di profondità o imaging ottico. Nonostante queste limitazioni, il nostro metodo può fornire la nuova comprensione nella elaborazione corticale dell'informazione. Ad esempio, è stato creduto sensoriale Agenzia ad emergere attraverso l'interazione rapide tra frontale e sensoriali; Tuttavia, i loro meccanismi rimangono poco chiari, poiché questo flusso di informazioni veloce, su larga scala, corticale è difficile monitorare senza il metodo presentato qui.

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Disclosures

MK sta facendo domanda per un brevetto su tutto-corticale matrice ECoG che aver usato in questo protocollo (n. 2018-210975).

Acknowledgments

Ringraziamo Yuri Shinomoto per fornire la cura degli animali, la formazione e le registrazioni sveglie. Le matrici di ECoG erano manufactured da Cir-Tech (www.cir-tech.co.jp). Inoltre, vorremmo ringraziare Editage (www.editage.jp) per la modifica di lingua inglese. Questo lavoro è stato supportato da Brain Mapping di neurotecnologie integrato per studi di malattia (cervello/mente), l'Agenzia giapponese per ricerca medica e lo sviluppo (AMED) (JP18dm0207001), il progetto di scienza di cervello del centro per il romanzo scienza iniziative ( CNSI), gli istituti nazionali di scienze naturali (NINS) (BS291004, M.K.) e dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI (JP17H06034, M.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker (100 cc) Outocrave
Cotton ball Outocrave
Absorption triangles Fine Science Tools Inc. 18105-03 Outocrave
Cotton swab with fine tip Clean Cross Co., Ltd. HUBY340 BB-013 Outocrave
Gauze Outocrave
Towel forceps Outocrave
Scalpel handle Outocrave
Needle Holder Outocrave
Iris Scissor Outocrave
Micro-Mosquito Forceps Outocrave
Adson, 1x2 teeth Outocrave
Bone Curette Outocrave
Micro spatura Fine Science Tools Inc. 10091-12 Outocrave
Needle Holders, 12.5 cm, Curved, Smooth Jaws World Precision Instruments 14132 Outocrave
Vessel Dilator, 12 cm, 0.1 mm tip Fine Science Tools Inc. 18131-12 Outocrave
Vessel Dilator, 12 cm, 0.2 mm tip Fine Science Tools Inc. 18132-12 Outocrave
Fine-tipped rongeur Fine Science Tools Inc. 16221-14 Outocrave
Manipurator of a stereotaxic frame Gas sterilization
Wrench for the manipurator Gas sterilization
Hand-made fixture for the connector Gas sterilization
Silicon cup for dental acril Gas sterilization
Silicon cup hlder Gas sterilization
Paintbrush Gas sterilization
Pencil Gas sterilization
Micro screw, 1.4 mm x 2.0 mm Nippon Chemical Screw Co., Ltd. PEEK/MPH-M1.4-L2 Gas sterilization
Screw driver for the micro screw Gas sterilization
Micromotor handpiece of a drill Gas sterilization
Stainless steel burr, 1.4 mm Gas sterilization
Stainless steel burr, 1.0 mm Gas sterilization
Drill bit, 1.2 mm Gas sterilization
Rubber air blower Gas sterilization

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References

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Impianto cronico di tutto-corticale Electrocorticographic Array nel Marmoset comune
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Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. J. Vis. Exp. (144), e58980, doi:10.3791/58980 (2019).More

Komatsu, M., Kaneko, T., Okano, H., Ichinohe, N. Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset. J. Vis. Exp. (144), e58980, doi:10.3791/58980 (2019).

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