Summary
Nous avons développé une gamme d’electrocorticographic ensemble-corticale pour l’ouistiti commun qui couvre sans interruption presque totalité de la surface latérale du cortex, du pôle occipital pour le temporel et poteaux frontaux. Ce protocole décrit une procédure d’implantation chronique du tableau dans l’espace péridural de cerveau ouistiti.
Abstract
Expression (ECoG) permet le suivi des potentiels de champ électrique du cortex cérébral avec une haute résolution spatio-temporelle. Développement récent des électrodes ECoG minces et flexibles a permis à la conduction d’enregistrements stables de l’activité corticale à grande échelle. Nous avons développé une gamme d’ECoG ensemble-corticale pour l’ouistiti commun. Le tableau en permanence couvre presque la surface latérale de hémisphère cortical, du pôle occipital pour le temporel et poteaux frontaux, et il capte tout-cortical activité neuronale d’un seul coup. Ce protocole décrit une procédure d’implantation chronique du tableau dans l’espace péridural de cerveau ouistiti. Ouistitis possèdent deux avantages au sujet de l’ECoG enregistrements, une étant l’organisation homologue des structures anatomiques chez les humains et les macaques, y compris les complexes frontales, pariétales et temps. L’autre avantage est que le cerveau d’ouistiti est lissencephalic et contient un grand nombre de complexes, qui sont plus difficiles d’accès chez les macaques avec ECoG, qui affleurent à la surface du cerveau. Ces fonctionnalités permettent un accès direct à la plupart des régions corticales sous la surface du cerveau. Ce système fournit une occasion d’étudier global informatique corticale avec haute résolution à un ordre de la milliseconde sous dans le temps et l’ordre de millimètre dans l’espace.
Introduction
Cognition nécessite la coordination des ensembles neurones à travers les réseaux de cerveau généralisée, particulièrement le néocortex qui s’est surtout développée chez les humains et semble pour être impliqué dans les comportements cognitifs plus élevés. Cependant, comment le néocortex permet d’obtenir ce comportement cognitif est un problème non résolu dans le domaine des neurosciences. Développement récent des électrodes electrocorticographic mince et flexible (ECoG) permet la conduction d’enregistrements stables de l’activité corticale à grande échelle1. Fujii et ses collègues ont mis au point un tableau ECoG ensemble-cortical de macaque singe2,3. Le tableau en permanence couvre presque l’ensemble cortex latéral, du pôle occipital vers les pôles temporale et frontales et capture l’activité neuronale corticale-ensemble d’un seul coup. Nous avons développé davantage ce système pour application dans l’ouistiti commun4,5, un singe petit, nouveau monde avec manipulation génétique6,7. Cet animal a plusieurs avantages par rapport aux autres espèces. Les visuels, auditifs, somesthésiques, moteur et les aires corticales frontales de cette espèce ont été précédemment mappé et auraient organisation homologue de base pour les mêmes secteurs dans les humains et les macaques8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. leurs cerveaux est lisses, et les aires corticales plus latérales affleurent à la surface du cortex, qui est plus difficile d’accès avec ECoG chez les macaques. Se fondant sur ces fonctionnalités, l’ouistiti est adapté aux études electrocorticographic. En outre, les ouistitis manifester des comportements sociaux et ont été proposées pour servir de modèle de comportements sociaux humains17candidats.
Ce protocole décrit une procédure d’implantation péridurale du tableau ECoG sur la surface entière latérale du cortex dans un ouistiti commun. Il offre la possibilité de surveiller l’activité corticale à grande échelle des neurosciences corticale primates, y compris les sensorielles, motrices, les domaines cognitifs et sociales plus élevés.
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Protocol
Ce protocole a été effectué sur 6 ouistitis (4 mâles, 2 femelles ; poids corporel = 320-470 g ; âge = 53-14 mois). Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux recommandations de la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique RIKEN (No. H28-2-221(3)). Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie, et tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés ainsi que leur malaise.
1. préparation
- Obtenir une image de résonance magnétique structurelle (MRI) de chaque cerveau individuel. Cela servira à identifier les emplacements des électrodes par l’enregistrement avec un ouistiti cerveau atlas et ordinateur par tomodensitométrie (TDM).
- Préparation du tableau ECoG : préparer un tableau personnalisé de l’ECoG multicanaux (Figure 1 a). Un tableau de ECoG 96ch se compose de deux feuilles avec électrodes 32 et 64. Pour tenir compte des différences individuelles dans la taille du cerveau, le tableau de l’ECoG a un bras flexible. Le bras peut couvrir le pôle temporal, selon la forme du cerveau individuel. Placer les électrodes de référence dans le sens contraire des électrodes ECoG et l’électrode de masse dans la même direction.
- Assembler le tableau ECoG avec un boîtier de connecteur (Figure 1 b) et sceller les lacunes du connecteur (Figure 1) à l’aide de colle acrylique pour empêcher l’afflux de liquide pendant l’opération. Stériliser le tableau avec l’oxyde d’éthylène.
- Préparer et stériliser les instruments.
Remarque : Tous les instruments utilisés sont énumérés dans la Table des matières.
2. implantation d’ECoG tableau
Remarque : Retirer l’ingestion d’aliments et de liquides de plus de 4 h avant la chirurgie. Exécutez toutes les étapes chirurgicales avec une technique aseptique à l’aide d’instruments et gants stérilisés.
-
Procédures avant implantation
- Induire anesthésie chez l’ouistiti par injection intramusculaire (i.m.) de kétamine (15 mg/kg) 5 min après l’injection i.m. l’atropine (0,08 mg/kg).
- Une anesthésie et maintenir l’anesthésie à l’isoflurane (1-3 % dilué avec un mélange d’oxygène/protoxyde d’azote) selon l’état physiologique de l’animal, qui doit être surveillée de façon continue. Veiller à ce que la fréquence cardiaque est de 130 à 180 BPM et moniteur de température corporelle et la saturation artérielle en oxygène (SpO2) en continu pour juger l’état de l’animal.
- Raser le dessus de la tête de l’animal avec les clippers et un épilateur. Rincer entièrement épilation écrémer la peau avec de la gaze humide, ou il peut endommager la peau.
- Administrer un antibiotique (cefovecin ; 16 mg/kg s.c.), antihypertenseur (furosémide, i.m. 2,0 mg/kg) et antihemorragiques (carbazochrome sulfonate de sodium hydraté ; i.m. de 0,2 mg/kg).
- Placez l’animal sur un cadre stéréotaxique. A cette époque, appliquer gelée de lidocaïne 2 % à l’oreille-bars et pommade ophtalmique aux yeux à prévenir la sécheresse et la douleur postopératoire.
- Désinfecter la zone chirurgicale avec la solution d’iode et couvrez-la avec rideaux stérilisé. Appliquez de la gelée de lidocaïne 2 % au lieu de l’incision cutanée.
-
Procédures d’implantation
- Inciser la peau environ 4 cm par l’intermédiaire de la ligne médiane du cuir chevelu avec un scalpel. Détacher le muscle temporal du crâne avec une curette jusqu'à ce que toute la zone chirurgicale est exposée. Nettoyer les tissus sur la surface du crâne et arrêter le saignement complètement avec hémostase de pression et avec de la cire de l’os, si nécessaire. Enrouler le bord de la peau et les muscles avec une gaze humide. Garder la gaze imbibée pendant la chirurgie.
- Placez le bord frontal du tableau sur le bord du pôle frontal. Marquer un espace prévu pour la craniotomie, fentes et trous sur le crâne avec un crayon stérile. L’emplacement de craniotomie dépendra de la conception du tableau (Figure 2).
- Percer la craniotomie le long de la marque 1, comme illustré à la Figure 2. Pendant le forage de l’os, soufflez de l’air à la pointe de maintenir une vision claire pour le chirurgien. Ensuite, couper l’os tout autour du mark 2, comme la pièce osseuse sera toujours attachée à dura au centre. Soulevez délicatement le morceau d’un bord et décollez la dura avec une spatule. Ce processus doit être réalisé lentement et soigneusement, ou il va déchirer la dura facilement.
- Enlever les bouts de l’os de la pièce osseuse et enrouler la pièce avec de la gaze humide, car cette pièce sera retournée après l’implantation du tableau.
- Effectuer la craniotomie 3 et 4, comme illustré à la Figure 2. Permettent l’insertion d’électrodes dans l’orbitofrontal et zones occipitales, respectivement.
- Percer les fentes sur la marque 5 tel qu’illustré à la Figure 2. Ces fentes permettent d’examiner le tableau pour s’assurer qu’il est correctement inséré.
- La dure-mère sera désormais exposée. Laver la zone avec du sérum physiologique et arrêter le saignement avec hémostase de pression et une éponge de gélatine, si nécessaire. Le bord de la craniotomie ouvert peut doivent être nettoyées avec un rongeur curette ou osseuse.
- Faire les fentes (marqués 6 dans la Figure 2) dans lequel sont placées les électrodes de référence. Placer les électrodes de référence dans l’espace péridural dans les zones de sensorimotrices et occipitales controlatéral. La position doit être déterminée selon les besoins expérimentaux.
- Percer les trous de vis à quatre points autour de chaque tige du connecteur avec une vis de 1,0 mm (croix à la Figure 2). Pour ne pas endommager l’affaire dura, insérez une spatule sous le crâne. Ces trous doivent être orthogonales sur le crâne. Ensuite, installez les vis PEEK (1,4 x 2,5 mm) comme points d’ancrage pour fixer le connecteur sur le crâne.
- Insérer le tableau ECoG dans l’espace épidural. Utilisation à tête plate pince destinée à contenir le tableau.
Remarque : Le tableau doit être inséré sans plier. Si le tableau est plié, créer un espace approprié en insérant une spatule entre le crâne et dura. Si la flexion est dû à la taille relativement petite du cerveau, couper certains des électrodes. - Fixer les électrodes de référence et au sol avec une acrylique dentaire. Placer les électrodes de référence dans l’espace épidural et l’électrode de masse sur la surface crânienne. Les deux contacts doivent faire face le crâne.
- Remettre la pièce osseuse et fixer le tenon connecteur et la tête avec un crâne d’acrylique dentaire sur les vis.
- Suture de la peau avec du nylon 6-0 sur le front et l’arrière tête et fixer la peau sur les côtés du connecteur à l’aide de fermetures de la peau.
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Procédures post-implantatoire
- Retirer l’animal du cadre stéréotaxique. Veiller à ce que l’animal reste chaud et fourni avec de l’oxygène aux étapes suivantes.
- Immédiatement après la chirurgie, injecter l’animal avec meloxicam (i.m. 0,3 mg/kg) pour diminuer la douleur postopératoire. Administrer un anti-inflammatoire corticoïdes (dexaméthasone ; i.m. 2,0 mg/kg) et la perfusion sous-cutanée (solution de Ringer amorcez ; 5,0 mL), y compris la famotidine (0,5 mg/kg) comme un gastroprotectant.
Remarque : Une administration concomitante d’AINS avec des stéroïdes a un potentiel d’effets secondaires gastro-intestinaux. - Après que l’animal a récupéré (confirmer par fréquence cardiaque et SpO2), supprimer la surveillance des signes vitaux et transférer l’animal dans l’ICU pendant 2-3 jours.
3. traitement postopératoire
Remarque : Cela prend généralement de 5 jours pour les animaux à se remettre complètement de la chirurgie.
- Pour éviter un gonflement de cerveau, administrer la dexaméthasone, un corticostéroïde anti-inflammatoire (2,0 mg/kg) deux fois par jour le premier jour après la chirurgie. Ensuite, réduire la dose de 1,5 mg/kg deux fois par jour sur les deuxième et troisième jours et 1 mg/kg deux fois par jour le quatrième jour.
- Administrer le soulagement de la douleur (meloxicam ; 0,1 mg/kg par voie orale une fois par jour) et un antihemorragiques (sulfonate de sodium carbazochrome hydrate, i.m. de 0,2 mg/kg, deux fois par jour) pendant 5 jours après la chirurgie.
Remarque : Dans notre cas, 1 à 2 jours après la chirurgie, des ouistitis (3 sur 6) est devenu moins actif et régurgitation. Cela peut être dû à une hypertension intracrânienne en raison d’un caillot de sang. Lorsque ouistitis présenté ces symptômes, nous a rouvert la tête et supprimé le caillot sous anesthésie générale (alfaxalone). Si il n’y avait aucune flexion du tableau ECoG pendant l’implantation, le caillot sanguin était probablement dans l’espace entre le tableau et où la pièce osseuse a été retournée. Dans ce cas, le caillot de sang peut être lavé, décédé en exécutant saline dans l’espace à l’aide d’un cathéter. Cette procédure conduit généralement à la récupération chez l’animal. -
Identification des emplacements de l’électrode
- Environ 1 semaine après la chirurgie, effectuer un balayage de tomodensitométrie (TDM) ordinateur de tête de l’animal.
Remarque : Il s’agit d’une bonne occasion de vérifier si les signaux peuvent être enregistrés correctement. Ouvrir le boîtier de connecteur et retirer les caillots de sang s’ils sont présents. - Aligner les IRM pondérées en T2 pour coordonnées stéréotaxiques utilisant AFNI logiciel18 (https://afni.nimh.nih.gov) (Figure 3 a). Aligner l’image de CT d’images IRM anatomiques pondérées en T2 avec Alvarez (Figure 3 b). S’inscrire à un atlas de cerveau ouistiti au MRI (Figure 3) avec Alvarez et fourmis19.
- Environ 1 semaine après la chirurgie, effectuer un balayage de tomodensitométrie (TDM) ordinateur de tête de l’animal.
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Representative Results
Le tableau ECoG ensemble-corticale peut capturer simultanément l’activité neuronale de l’intégralité d’un hémisphère. La figure 4 montre des exemples de potentiels évoqués auditifs (SPEA) de multiples zones auditives dans un ouistiti éveillé. ECoG enregistrements ont été effectués dans des conditions d’écoute passives. Chaque ouistiti a été exposé à des stimuli auditifs, qui se composait de sons purs randomisés avec 20 types de fréquence. Ensuite, nous avons calculé la SPEA en faisant la moyenne ECoGs aligné avec les seuils des tons. Formes d’onde différentes ont été observées d’inférieur et supérieur auditifs zones, ce qui indique que la résolution spatiale de notre tableau ECoG peut capturer d’information différente dans différentes aires corticales.
Figure 1 : préparation d’un tableau ECoG. (A) 32 et 64 ECoG tableaux (en bas à gauche et à droite), un boîtier de connecteur (en haut à gauche) et un front-end pour les systèmes d’enregistrement (en haut à droite). « G » et « R » de chaque tableau indiquent grand et référencent des électrodes, respectivement. (B) tableau ECoG assemblés. (C) toutes les lacunes (rectangles rouges) devraient être scellés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : exemple de la craniotomie. (A), le noir gris et épais mince lignes indiquent les contours du tableau ECoG et la zone prévue de craniotomie, respectivement. Les croix correspondent aux trous d’ancrage. Le nombre entouré d’un cercle indique l’ordre de perçage. Image (B) un exemple CT de la craniotomie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : localisation de chaque électrode. (A) pondérées en T2 MRI, CT (B) et (C) électrode emplacements sur l’atlas. L’atlas utilisé dans ce manuscrit est le Woodward version 3D basée sur la Hashikawa-atlas20, qui est une carte de MRI-cytoarchitectual. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : exemples de potentiels évoqués auditifs. (A) l’aire auditive du singe J. (B) des exemples de la SPEA. Électrodes situés à divers endroits auditifs montrent des formes d’onde différentes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| 09:00 | Commencer les préparatifs |
| 10:00 | Inciser la peau |
| Exposition du crâne (10 min) | |
| Craniotomie (30 min) | |
| 11:00 | Départ pour insérer le tableau |
| Insérer le tableau (60 min) | |
| 12:30 | Peau étroite |
Tableau 1 : Recommandé : évolution temporelle de la chirurgie.
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Discussion
Pour une implantation réussie, animaux devrait être fourni avec une nutrition adéquate avant et après la chirurgie. Courte durée de fonctionnement est également important d’optimiser la récupération de l’animal. Préparations devraient être terminées au moins une journée avant la chirurgie. Pour réduire le temps de fonctionnement, une formation préalable de craniotomie avec insertion de tableau des électrodes chez les animaux terminés à d’autres fins expérimentales est recommandée. Le tableau 1 montre un exemple de l’évolution temporelle de ce protocole.
Nous avons modifié le traitement de procédure et post-opératoire de l’anesthésie sur une base de cas-par-cas. Dans le présent protocole vidéo, les animaux ont été anesthésiés et maintient à l’aide d’un mélange d’isoflurane et oxygène délivré par le biais de l’intubation trachéale. Isoflurane peut être remplacé par sévoflurane et l’intubation trachéale peut être remplacé par un masque. Dans d’autres cas, nous anesthésiés animaux avec une injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et de la médétomidine. Dans ce cas, animaux était initialement sous sédation avec butorphanol (i.m. de 0,2 mg/kg), et anesthésie chirurgicale a été réalisée avec un mélange de kétamine (i.m. de 30 mg/kg) et de la médétomidine (i.m. 0,35 mg/kg).
Car ECoG enregistre directement les changements dans les domaines électriques, sa résolution temporelle est limitée par le système d’enregistrement. La résolution maximale de temps de notre système d’enregistrement est de 30 kHz. Habituellement, nous avons échantillonné des signaux à une fréquence d’échantillonnage de 1 kHz et ont trouvé que cela suffira pour l’extraction de l’information sensorielle/moteur.
Résolution spatiale dépend de la conception de l’électrode. Dans le présent protocole, chaque contact entre l’électrode a été de 0,8 mm de diamètre et offrait une distance inter électrode de 2,5 mm. Nous avons observé les différentes formes d’onde de trois électrodes situées dans différents domaines auditifs et séparés par 2,5 mm (ch18, ch19, ch20 dans la Figure 4). Ainsi, la résolution spatiale de nos électrodes est estimée à moins de 2,5 mm. Dans certains cas, les contacts de l’électrode sont trouvaient plus étroitement les uns aux autres. Dans ces cas, la résolution spatiale est plus fine.
Avec succès, nous avons enregistré des signaux neurones à long terme avec la bonne qualité. Dans un cas, le connecteur et acrylique dentaire ont été détachées du crâne, et l’électrode a été brisé à 4 mois après la chirurgie. Cela était dû à la croissance des tissus à cause de sang étant contenue entre l’acrylique dentaire et le crâne pendant une intervention chirurgicale. Un autre ouistiti a été résilié en raison d’une exigence expérimentale 5 mois après la chirurgie. Quatre animaux participent encore à des expériences (1 année, 7 mois, 4 mois, et 4 mois après la chirurgie, respectivement).
ECoG baies sont généralement implantés dans l’espace sous-dural chez les humains et les macaques. Cependant, moins invasives implantations péridurales conviennent mieux à ouistitis, parce que ce sont des animaux fragiles. La dure-mère mince relatif ouistitis nous a permis de contrôler les signaux de haute fréquence cérébrale, même si le tableau ECoG a été implanté sur la dure-mère. L’un des inconvénients de la péridurale implantation est des difficultés à accéder à n’importe quel cortex dans un sillon et le cortex de la ligne médiane. Approcher ces cortex nécessite l’incision de l’affaire dura. En outre, ECoG tableaux étant électrodes de surface, il est difficile de préciser la source de signal en termes de profondeur corticale. Afin de comprendre le traitement dans le cortex de l’information précise, il est nécessaire d’inclure d’autres méthodes, telles que les électrodes de profondeur ou imagerie optique. Malgré ces limites, notre méthode peut fournir nouvel aperçu sur le traitement de l’information corticale. Par exemple, l’agence sensorielle a cru d’émerger grâce à des interactions rapides entre les zones frontales et sensoriels ; Cependant, leurs mécanismes demeurent assez obscurs puisque cette circulation de l’information rapide, à grande échelle, corticale est difficile à suivre sans que la méthode présentée ici.
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Disclosures
MK est une demande pour un brevet sur son ensemble-cortical ECoG tableau elle utilisé dans le présent protocole (no 2018-210975).
Acknowledgments
Nous remercions Yuri Shinomoto pour fournir des soins aux animaux, la formation et les enregistrements éveillés. Les baies ECoG ont été fabriqués par Cir-Tech (www.cir-tech.co.jp). En outre, nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l’édition de langue anglaise. Ce travail a été soutenu par le Brain Mapping par Neurotechnologies intégrée pour les études de la maladie (cerveau/esprit), l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) (JP18dm0207001), le projet de Science du cerveau du centre pour les Initiatives scientifiques roman ( CNSI), les instituts nationaux des Sciences naturelles (Nikita) (BS291004, M.K.) et par la société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS) KAKENHI (JP17H06034, M.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker (100 cc) | Outocrave | ||
| Cotton ball | Outocrave | ||
| Absorption triangles | Fine Science Tools Inc. | 18105-03 | Outocrave |
| Cotton swab with fine tip | Clean Cross Co., Ltd. | HUBY340 BB-013 | Outocrave |
| Gauze | Outocrave | ||
| Towel forceps | Outocrave | ||
| Scalpel handle | Outocrave | ||
| Needle Holder | Outocrave | ||
| Iris Scissor | Outocrave | ||
| Micro-Mosquito Forceps | Outocrave | ||
| Adson, 1x2 teeth | Outocrave | ||
| Bone Curette | Outocrave | ||
| Micro spatura | Fine Science Tools Inc. | 10091-12 | Outocrave |
| Needle Holders, 12.5 cm, Curved, Smooth Jaws | World Precision Instruments | 14132 | Outocrave |
| Vessel Dilator, 12 cm, 0.1 mm tip | Fine Science Tools Inc. | 18131-12 | Outocrave |
| Vessel Dilator, 12 cm, 0.2 mm tip | Fine Science Tools Inc. | 18132-12 | Outocrave |
| Fine-tipped rongeur | Fine Science Tools Inc. | 16221-14 | Outocrave |
| Manipurator of a stereotaxic frame | Gas sterilization | ||
| Wrench for the manipurator | Gas sterilization | ||
| Hand-made fixture for the connector | Gas sterilization | ||
| Silicon cup for dental acril | Gas sterilization | ||
| Silicon cup hlder | Gas sterilization | ||
| Paintbrush | Gas sterilization | ||
| Pencil | Gas sterilization | ||
| Micro screw, 1.4 mm x 2.0 mm | Nippon Chemical Screw Co., Ltd. | PEEK/MPH-M1.4-L2 | Gas sterilization |
| Screw driver for the micro screw | Gas sterilization | ||
| Micromotor handpiece of a drill | Gas sterilization | ||
| Stainless steel burr, 1.4 mm | Gas sterilization | ||
| Stainless steel burr, 1.0 mm | Gas sterilization | ||
| Drill bit, 1.2 mm | Gas sterilization | ||
| Rubber air blower | Gas sterilization |
References
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