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Methodenartikel

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

7.4K Aufrufe

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DOI:

10.3791/59020

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9. Februar 2019

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1Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering, Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering, Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D, Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering, Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

Zusammenfassung

Tumor-Sphäroide wurden als eine dreidimensionale (3D) Kultur Zellmodell in der Krebs-Forschung und Anti-Krebs-Wirkstoffforschung entwickelt. Jedoch Hochdurchsatz-bildgebende Modalitäten Verwendung von hellen Feld oder Fluoreszenz-Detektion, derzeit nicht in der Lage, die insgesamt 3D-Struktur des Tumor-Sphäroid aufgrund begrenzter Lichtdurchlässigkeit, Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen zu lösen und Tiefe-Abwicklungsfähigkeit. Vor kurzem, unser Labor demonstriert die Verwendung der optischen Kohärenztomographie (OCT), ein markierungsfreie und zerstörungsfreie 3D bildgebende Modalität, um längs Charakterisierung von mehrzelligen Tumor Sphäroide in eine 96-Well-Platte auszuführen. OCT war in der Lage, 3D morphologischen und physiologischen Informationsbeschaffung der Tumor Sphäroide wächst bis zu ca. 600 µm in der Höhe. In diesem Artikel zeigen wir eine Hochdurchsatz-Okt (HT-Okt) Image System, die scannt die gesamte Multi-well-Platte und OCT 3D-Daten der Tumor Sphäroide automatisch erhält. Wir beschreiben die Details der HT-OCT-System und Bau Richtlinien im Protokoll. Aus den 3D-Daten OCT einer visualisieren die Gesamtstruktur der Sphäroid mit 3D gerendert und orthogonale Scheiben Längenwachstums Kurve von der Tumor-Sphäroid morphologische anhand von Größe und Volumen zu charakterisieren und überwacht das Wachstum von die toten Zellen Regionen in der Tumor-Sphäroid basierend auf optische intrinsischen Dämpfung Kontrast. Wir zeigen, dass HT-OCT als Hochdurchsatz-bildgebende Modalität für Drug screening sowie die Charakterisierung von Biofabricated Proben verwendet werden kann.

Einleitung

Krebs ist die zweithäufigste Ursache des Todes in der Welt1. Medikamente gegen Krebs zu entwickeln, ist von entscheidender Bedeutung für die Patienten. Jedoch wird es geschätzt, dass mehr als 90 % der neue Anti-Krebs-Medikamente in der Entwicklungsphase wegen mangelnder Wirksamkeit und unerwartete Toxizität in klinischen Studien2scheitern. Der Teil des Grundes lässt sich zurückführen auf die Verwendung von einfachen zweidimensionalen (2D) Kultur Zellmodelle für zusammengesetzte Screening, die Ergebnisse mit begrenzten Vorhersagewerte der zusammengesetzten Wirksamkeit und Toxizität für die folgenden Phasen des Drug Discovery2 , 3 , 4. vor kurzem, dreidimensionale (3D) Tumor Sphäroid Modelle wurden entwickelt, um klinisch relevante physiologische und pharmakologische Daten vorsehen, Anti-Krebs-Medikament Entdeckung3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Da diese Sphäroide Gewebe-spezifische Eigenschaften von Tumoren in Vivonachahmen können, können wie Nährstoffe und Sauerstoff gradient, hypoxische Kern sowie Medikament Widerstand19, die Verwendung dieser Modelle potenziell Drug Discovery Fristen zu verkürzen, reduzieren Sie Investitionskosten zu, und bringen Sie neue Medikamente für Patienten noch effektiver. Ein kritischer Ansatz zur Bewertung zusammengesetzte Wirksamkeit in 3D Tumorentwicklung Sphäroid ist zur Überwachung der Sphäroid Wachstum und Wiederauftreten nach Behandlungen9,26. Um dies zu tun, sind quantitative Charakterisierung der Tumor Morphologie, mit seinen Durchmesser und Volumen, mit hochauflösender bildgebender Verfahren zwingend notwendig.

Konventionelle bildgebende Verfahren, z. B. Hellfeld Phase Kontrast7,9,22,24und Fluoreszenz-Mikroskopie8,9,16, 18,22 kann eine Messung des Durchmessers der Sphäroid bieten aber nicht die allgemeine Struktur der Sphäroid im 3D-Raum lösen. Viele Faktoren tragen zu dieser Beschränkungen, einschließlich Eindringen von bohrenden Licht in den Sphäroid; Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in den Sphäroid; emittierenden Leuchtstoff Signale von aufgeregt fluoreszierende Farbstoffe im Inneren oder auf der gegenüberliegenden Fläche des Sphäroids aufgrund der starken Absorption und Streuung; und Tiefe-Abwicklungsfähigkeit dieser bildgebende Modalitäten. Dies führt häufig zu einer ungenauen Volumenmessung. Entwicklung des nekrotischen Kerns in Sphäroide imitiert Nekrose in in Vivo Tumoren6,10,15,19,25. Diese pathologische Funktion dürfte in 2D Zelle Kulturen19,25,27,28reproduziert. Sphäroid größer als 500 µm im Durchmesser, eine Dreischicht-konzentrische Struktur, einschließlich eine äußere Schicht der proliferierenden Zellen, eine mittlere Schicht von ruhenden Zellen und einem nekrotischen Kern in der Sphäroid6,10 zu beobachten ,15,19,25, aufgrund des Mangels an Sauerstoff und Nährstoffe. Lebende und tote Zelle Fluoreszenz-Bildgebung ist die Standardtherapie, die Grenze des nekrotischen Kern zu kennzeichnen. Allerdings behindern Durchdringungen dieser fluoreszierende Farbstoffe und sichtbares Licht wieder, das Potenzial, die Sonde in den nekrotischen Kern, seine Entwicklung in seiner eigentlichen Form zu überwachen.

Eine alternative 3D bildgebende Modalität, ist Optische Kohärenztomografie (OCT) eingeführt, um den Tumor Sphäroide charakterisieren. OCT ist eine biomedizinische bildgebendes Verfahren, die für den Erwerb markierungsfreie, zerstörungsfreie 3D-Daten von bis zu 1-2 mm Tiefe in biologischen Geweben29,30,31,32,33 ,34. OCT beschäftigt Low-Kohärenz Interferometrie zurückgestreute Signale aus verschiedenen Tiefen der Probe zu erkennen und rekonstruierten Tiefe gelöst Bilder bei Mikron-Ebene räumliche Auflösungen im lateralen und vertikalen Richtungen bietet. OCT ist weit verbreitet in der Augenheilkunde35,36,37 und Angiographie38,39angenommen worden. Frühere Studien haben OCT zu beobachten die Morphologie von in-vitro- Tumor Sphäroide Basalmembran Matrix (z.B.Matrigel) und evaluieren ihre Reaktionen auf die photodynamische Therapie40,41verwendet. Vor kurzem hat unsere Gruppe eine Hochdurchsatz-OCT Image Plattform, um systematisch zu überwachen und zu quantifizieren, die Wachstum Kinetik der 3D Tumor Sphäroide im Multi-well-Platten42. Präzise volumetrische Quantifizierung der 3D Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie nekrotischen Gewebes Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung Kontrast wurden demonstriert. Dieses Papier beschreibt die Details wie die OCT-Bildgebung-Plattform wurde konstruiert und eingesetzt, um hochauflösende 3D-Bilder von Tumor Sphäroide zu erhalten. Schritt für Schritt Quantitative Analysen der Kinetik von 3D Tumor Sphäroide, genaue Messungen der Sphäroid Durchmesser und Volumen, einschließlich Wachstum wird beschrieben. Darüber hinaus wird die Methode der zerstörungsfreien Detektion des nekrotischen Gewebes Regionen mit OCT, basierend auf der inneren optische Dämpfung Kontrast präsentiert.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen

  1. Ein qualifizierter Lieferant Zelllinien einzuholen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Zellen von der Zell-Linien von Interesse Sphäroid in den Kultur-Medien oder mit Hilfe eines Substrates (Basalmembran Matrix wie Matrigel) bilden können. Schauen Sie in der Literatur-9 oder durchführen Sie einer Runde eines Pre-Experiment für einen Check.
  2. Tauen Sie die gefrorenen Zellen nach dem spezifischen Verfahren von der Zelllinie Anbieter zur Verfügung gestellt. Ein allgemeines Verfahren finden Sie ebenfalls43.
  3. Kultur der Zellen für 1-2 Durchgänge in 25 cm2 Kulturflaschen. Die Zellen sind dann bereit für 3D Zellkultur verwenden.
  4. Überwachen Sie der Gesundheitszustand der Zellen jeden Tag zu und pflegen sie im Brutkasten unter Standardbedingungen (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2). Aktualisieren Sie die Medien, je nach Bedarf.
    Hinweis: Das Kulturmedium besteht aus DMEM (4,5 g/L Glukose), 1 % Antibiotikum Antimykotikums fötalen Rinderserum 10 %. Subkultur Zellen bevor sie Zusammenfluss in der Kultur-Kolben erreichen. Folgen Sie der Zelle Kultur Leitlinie des Anbieters. Ein allgemeines Verfahren finden Sie in Elsehwhere44.
  5. Führen Sie 3D Zellkultur im Multi-well-Platten anhand der folgenden allgemeinen Protokolls9.
    1. Entfernen Sie die Nährmedien aus der Kultur-Flasche zu und waschen Sie ihn mit sterilisierten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, auf 37 ° C erhitzt).
    2. Aufschwemmen der Zellen durch Zugabe von 1 mL Trypsin Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA, 0,5 %) in den Kolben 3 Minuten lang. Fügen Sie dann Kultur Medien um die Trypsin zu verdünnen.
    3. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 5 min bei 500 X g und Raumtemperatur.
    4. Entfernen des Überstands und Zellen mit 4 mL vorgewärmten Kulturmedium aufzuwirbeln. Pipette einen Tropfen der Probe auf eine Hemocytometer für die Zellzählung Zellkonzentration ermitteln. Verdünnen Sie die Zellen, die entsprechende Konzentration für die Aussaat (z.B.3.000 Zellen/mL).
      Hinweis: Optimieren Sie die erste Zelle Konzentration der Sphäroid für jede Zelllinie und jede Art von Multi-well-Platte (96-Well, 384-Well oder 1536-Well).
    5. Samenzellen in eine extrem niedrige Anlage (ULA) Runde Talsohle Multi-well-Platte. Fügen Sie 200 µL Zellen Suspension in jede Vertiefung in der Konzentration von 3.000 Zellen/mL, so dass jeder gut etwa 600 Zellen hat.
    6. Zentrifugieren Sie bei RT die ganze Platte mit einem Teller-Adapter für 7 min., gleich nach der Aussaat, bei einer Geschwindigkeit von 350 x g oder die niedrigste Geschwindigkeit zur Verfügung.
      Hinweis: Die Zentrifuge hilft Zellen in die Mitte des Brunnens zu erleichtern, bilden ein einheitliches Sphäroid zu sammeln. Die Zentrifuge Schritt erfolgt nur einmal am Anfang, um den Tumor Sphäroide bilden. Es wird nicht wiederholt werden, wenn der Tumor Sphäroide beginnen zu wachsen.
    7. Pflegen Sie die Multi-well-Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem Inkubator Kultur und aktualisieren Sie die Nährmedien alle 3 Tage.
      Hinweis: Wachstumszeit kann für verschiedene 3D Kulturbedingungen variieren. In unserer Studie ist 3.000 Zellen/mL für u-87 MG und HCT-116 Zelllinien in 96-Well-Platten verwendet, so dass das Sphäroid, ~ 500 μm in 4\u20127 Tage für die HCT-116 Zellen wachsen kann. Erwägen Sie, Medien-Ergänzungen und Wachstumsfaktoren für verschiedene Sphäroid Modelle, basierend auf der allgemeinen 3D Culture-Protokoll.
    8. Durchführen Sie OCT-Bildgebung der Tumor Sphäroide alle 3\u20124 Tage für eine Längsschnittstudie ihres Wachstums.
      Hinweis: Empfohlene Zeitpunkte für die OCT-Bildgebung wäre Tag 4, Tag 7, Tag 11, Tag 14, Tag 18 und Tag 21.

2. High-Throughput OCT Imaging Plattform

Hinweis: Siehe verwiesen Arbeit29,30,31,32,33,34 für eine gründliche Überprüfung der Prinzipien und Anwendungen der OCT. Siehe Abbildung 1 und Huang Et al. 42 für Details des imaging-System in dieser Studie verwendeten benutzerdefinierten OAT.

  1. Wählen Sie eine geeignete Breitband-Lichtquelle für das OCT-System für Tumor Sphäroid Bildgebung.
    Hinweis: Hier eine Superlumineszenz Diode (SLD, Abb. 1A,B) mit einer zentralen Wellenlänge ~ 1.320 nm und ~ 110 nm Bandbreite wurde als Breitband-Lichtquelle verwendet.
  2. Konstruieren Sie die Referenzarm und Probe Arm des OCT-Systems nach der Schaltpläne (siehe Abb. 1A,B für Details). Sehen Sie Tabelle der Materialien für eine Liste der optischen Komponenten der OCT-System zu errichten. Stellen Sie sicher, dass die optische Weglänge der Referenzarm und Probe Arm sind eng aufeinander abgestimmt.
  3. Konstruieren Sie das Spektrometer, darunter ein Kollimator, ein Gitter, eine F-Theta-Objektiv und eine Zeilenkamera (siehe Abbildung 1 für Setup34) für Details der Spektrometer-Design von Okt. alternativ eine kommerzielle Spektrometer auswählen, entspricht die Zentrum-Wellenlänge der Lichtquelle. Stellen Sie sicher, dass das Spektrometer korrekt ausgerichtet ist, um die gesamte Laser-Bandbreite, zu hohe Photon Abscheidegrad zu erreichen und zur langsamen Auswaschen der das Interferenzmuster zu decken.
  4. Die Leistung des Systems der OCT, namentlich die folgenden Metriken wie Probe Arm macht, total imaging tiefenabhängige Empfindlichkeit, axiale Auflösung, Tiefe, Tiefe des Fokus und laterale Auflösung zu charakterisieren. Legen Sie einen schwachen Reflektor (z.B., ein Spiegel mit einem Graufilter) als eine Probe, die tiefenabhängige Empfindlichkeit, axiale Auflösung und Schärfentiefe zu messen. Legen Sie einen USAF Auflösung Test Chart Ziel wie die Probe, die laterale Auflösung zu überprüfen.
    Hinweis: Siehe Referenzen34,45 für Definitionen von Kennzahlen der OCT Leistung und Protokolle zu charakterisieren diese Metriken45. Siehe Tabelle 1 für eine Liste der gemessenen Parameter für das benutzerdefinierte OCT-System in unserer Studie verwendet.
  5. Wählen Sie eine motorisierte Verschiebetisch, horizontale Bewegung von Multi-well-Platte zu Bild Tumor Sphäroide in verschiedenen Brunnen (siehe Abbildung 1 b) bereitzustellen. Verwenden Sie eine Bühne mit einem größer als 108 x 72 mm Stellweg, um sicherzustellen, eine volle scannen alle Brunnen von Multi-well-Platte. Verwenden Sie eine 2D oder 3D motorisierte Verschiebetisch mit Softwaresteuerung, um genaue Lage der einzelnen Brunnen und Automatisierung der OCT-System für Hochdurchsatz-Bildgebung zu ermöglichen.
  6. Verwenden Sie einen Adapter Platte oder entwerfen ein Kennzeichenhalter (3D-Druck), um die Multi-well-Platte in einer festen Position zu halten.
  7. Korrigieren Sie die Neigung und Drehung der Multi-well-Platte mit einem 2D kippen, Bühne und einem Drehtisch montiert auf der translationalen Bühne (siehe Abbildung 1-D), vor der Durchführung OCT-Bildgebung zur Minimierung von Variation der Fokusebene aus verschiedenen Brunnen. Wenn ihre relativen Position in der OCT-Bildern (Abbildung 1A) Überwachung verwenden Sie D2, D11, B6, D6, G6 als leitenden Brunnen.
  8. Passen Sie die Drehung der Platte um sicherzustellen, dass die Kanten der Platte parallel mit der Richtung der Bewegung sind, so dass die Vertiefungen an den gleichen horizontalen Positionen in der OCT-Bildern (Abbildung 1E) bleiben. Stellen Sie die Neigung der Platte parallel zum optischen Tisch, so dass die Brunnen für OCT-Bildgebung (Abb. 1F) auf den gleichen vertikalen Positionen bleiben.
    Hinweis: Einstellung der kippbare Winkel und Fokus helfen die OCT-Bildqualität für die Brunnen zu optimieren. Variationen der Höhe des Kulturmedien in verschiedenen Brunnen führen Änderungen im optischen Pfade jedoch zur Defokussierung des Sphäroid Bildes führen. Auto-Fokus kann durchgeführt werden, zur Steuerung der Brennebene des OCT-Bildgebung um optimale Bildqualität zu erzielen. Die Anpassung Schritt löst nicht armen OCT Bildqualität des Tumor-Sphäroid aufgrund der folgenden Probleme: der Sphäroid Dezentrierung durch anfängliche seeding Lage; Sphäroid Höhe eingebettet in Biofabricated extrazellulären Matrizen; schlechte Platte Qualität mit großen Schwankungen der Höhe gut Böden. Zusätzliche Software-Steuerung mit Autofokus oder Selbstausrichtung Funktionen kann zur Optimierung der Leistung des Office-Anpassungstools imaging-System implementiert werden.
  9. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte Computerprogramm, um OCT-Bildaufnahme und der Tischbewegung nun nacheinander von jeder Datenerhebung zu kontrollieren.

3. OCT scannen und verarbeiten von Tumor Sphäroide

  1. Am Tag der OCT-Bildgebung der Tumor Sphäroide statt die Multi-well-Platte aus dem Inkubator. Die Multi-well-Platte unter Office-Anpassungstool imaging-System zu übertragen. Legen Sie es auf die Platte-Adapter.
    Hinweis: OCT-Bildgebung der Tumor Sphäroide kann mit dem Polystyrol Platte Deckel ein- oder ausschalten durchgeführt werden. Jedoch können die Wasser Verdichtungen auf dem Deckel durch Verdunstung aus den Brunnen Lichtdurchlässigkeit beeinflussen und verzerren den Lichtweg, weniger optimale OCT-Bilder aus der Sphäroide nachgeben.
  2. Passen Sie die Höhe der Platte durch Verschieben entlang der Z-Richtung der Übersetzung Stufe an. Pflegen die Brennebene Position bei ca. 100 – 200 μm unterhalb der Oberseite jedes Sphäroid, zur Minimierung der Auswirkungen der ungleichmäßigen Betonbewehrung focal Profil.
  3. Einen richtigen OCT Tastbereich (z.B. 1 x 1 mm) inmitten einer Individualsoftware zur Deckung der ganze Tumor Sphäroid nach seinen Entwicklungsstufen. Klicken Sie auf Speichern Parameter um die Einstellung zu speichern.
  4. Verwenden Sie die benutzerdefinierte Software OCT 3D-Bilder von Tumor Sphäroide eins nach dem anderen für die Brunnen der Platte mit Sphäroide zu erwerben. Klicken Sie auf Vorschau , um das Vorschaubild anzuzeigen und klicken Sie auf erfassen , um das OCT-Bild zu erwerben.
    Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die OCT Sphäroid Daten erhoben werden, wenn die Bühne nicht in Bewegung ist. Das Sphäroid befindet sich in der Regel in der Mitte des U-Boden gut. Jedoch kann das Sphäroid in den Kulturmedien verschoben werden, wenn die Bühne beschleunigen oder Abbremsen wegen der Trägheit der Sphäroid in den Kultur-Medien.
  5. Prozess-3D OCT Datasets von Tumor Sphäroide, OCT strukturelle Bilder mit eine benutzerdefinierte Verarbeitung der C++-Code zu erzeugen. Siehe Abbildung 2A für ein Flussdiagramm der Nachbearbeitung von OCT Daten.
    Hinweis: Siehe Abbildung 4A für die generierten 3D OCT strukturelle Bilder.
    1. Siehe Kapitel 5 Drexler und Fujimoto34 und Jian Et al. 46 für Detail-Beschreibungen der Nachverarbeitungsschritte OCT Daten. Die Pixelgröße in allen drei Dimensionen zu kalibrieren. Neu skalieren Sie die OCT strukturelle Bilder auf korrigierte Skalen.
      Hinweis: Der Abstand in axialer Richtung (Z-Richtung) von OCT-Bildern ist ein Maß der optischen Gangunterschied zwischen dem Referenzarm und Probe-Arm. Der Brechungsindex der Stichprobe (n) muss daher berücksichtigt werden, wenn die Pixelgröße in axialer Richtung für Skalierung zu kalibrieren. Wir verwenden in unserer Studie, n = 1,37 als der Brechungsindex der Tumor Sphäroid42.
  6. Generieren Sie die Collage der Sphäroid Bilder mit OCT 2D-Bilder in drei Cross-sectional XY, XZ und YZ-Ebenen über den Schwerpunkt der Sphäroid. Abbildung 3–E für die repräsentativen Ausgabe von Collagen Sphäroid Bilder zu sehen. Führen Sie Bild-Registrierung für alle Sphäroide, mit Hilfe der MATLAB-Funktion Dftregistration47, um sicherzustellen, dass die Zentroiden der Sphäroid etwa an der gleichen Stelle befinden.
  7. Erhalten Sie 3D-Rendering des Sphäroids mit einem kommerziellen oder benutzerdefinierte Software.
    Hinweis: Die folgenden Schritte zeigen, wie das 3D-Rendering des Tumors Sphäroide mit einer kommerziellen Software zu erhalten.
    1. Laden Sie die 3D OCT-Daten in die Software.
    2. Klicken Sie auf die Surpass -Panel. Klicken Sie auf Neues Volume hinzufügen. Wählen Sie die Füllmethode für 3D-Rendering verwenden .
    3. Passen Sie den Betrachtungswinkel durch das Bild mit dem Mauszeiger ziehen.

4. morphologische Quantifizierung der 3D Tumor Sphäroide

Hinweis: Ein benutzerdefinierte geschriebenen Code in MATLAB verarbeitet diese Quantifizierung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um den Vorgang zu starten. Siehe Abb. 2 b für das Flussdiagramm der Schritte der morphologischen Quantifizierung der Sphäroide.

  1. Sphäroid Durchmesser, Höhe und Durchmesser-basierte Volumen zu quantifizieren.
    1. Wählen Sie OCT 2D-Bilder in drei Cross-sectional XY, XZ und YZ-Ebenen, die den Schwerpunkt der Sphäroid kreuzen.
    2. Messen Sie den Durchmesser und die Höhe von der Sphäroid in XY und XZ Ebenen, beziehungsweise.
    3. Durchmesser-basierte Sphäroid Volume verwenden zu berechnen: figure-protocol-1 , mit eine Vermutung für die sphärische Form des Tumors.
  2. Voxel-basierte Sphäroid Volumen zu quantifizieren.
    1. Wenden Sie einen 3D durchschnittlichen Filter auf OCT Strukturdaten der Sphäroid, Flecken zu entfernen.
    2. Segment Tumor Sphäroide mit dem Canny Rand Erkennung48 Filter, Bild für Bild, mit einer richtigen Schwelle der Tumorregion Sphäroid von unten gut zu trennen.
    3. Verbindende Voxel für 3D-Daten zu gruppieren (siehe integrierte Funktion: Bwconncomp).
    4. Berechnen Sie die mittlere Entfernung zwischen jeder Bindegewebe Voxel in der Gruppe und der Sphäroid Zentroid (manuell gewählt), für jede Gruppe. Identifizieren der Sphäroid-Region als die Gruppe mit der mittleren Mindestabstand.
    5. Die Anzahl der Voxel innerhalb der Sphäroid-Region und multiplizieren dann durch das tatsächliche Volumen der eine einzelne Voxel (Volumen/Voxel), das Gesamtvolumen der Sphäroid nachgeben.

(5) tot-Cell Region Erkennung von 3D Tumor Sphäroide

Hinweis: In einem homogenen Medium, OCT zurückgestreute Intensität als Funktion der Tiefe (ich(Z)) erkannt kann beschrieben werden durch die Bier-Lambert Gesetz49: figure-protocol-2 , wo z die Tiefe entspricht, μ ist die optische Dämpfung Koeffizient, und ich0 ist die einfallende Intensität auf die Probe. Daher der abgeleiteten optische Dämpfung Koeffizient ausgedrückt werden kann: figure-protocol-3 . Seit OCT Bilder oft auf einer logarithmischen Skala dargestellt werden, kann die Steigung der OCT Intensität Profil abgerufen werden, um die optische Dämpfung Koeffizienten ableiten. Ein Flussdiagramm der Generation der optische Dämpfung Karten finden Sie unter Abbildung 2 .

  1. Führen Sie Segmentierung um unerwünschte Regionen außerhalb der Sphäroid zu entfernen. Führen Sie 3D durchschnittliche Filter, um das Speckle-Rauschen zu unterdrücken, das OCT-Bildern innewohnt.
  2. Pixelweise erhalten optische Dämpfung Koeffizienten durch lineare Montage der logarithmischen Skala OCT Intensität Profil über einen bestimmten Tiefenbereich (bewegliches Fenster), seine Neigung zu extrahieren und den Hang mit-1 multiplizieren/2.
    Hinweis: Der Koeffizient der Dämpfung bei jedem Voxel innerhalb der segmentierten Sphäroid Region basiert auf dem Hang des OCT Intensität Profil in einem 10-Voxel tiefe Fenster (~ 40 μm in der Tiefe), mit der Voxel befindet sich in der Mitte des Fensters berechnet.
  3. Wenden Sie die Methoden oben (Schritt 5.1 und 5.2) zu jedem axiale Scan in einem Frame und jeden Frame in einem 3D Dataset mit der segmentierten Sphäroid Region bis optische Dämpfung Koeffizienten für alle Voxel der segmentierten Sphäroid Region berechnet werden.
  4. Führen Sie die binäre Schnittstellenüberwachung um die hohe Dämpfung Region hervorzuheben.
    Hinweis: Siehe Huang Et al. 42 für die Bestimmung der Schwelle der Histogramm-Analyse mit hoher Dämpfung Region.
  5. Markieren Sie die binarisierten optische Dämpfung-Karte auf das Originalbild die Toten-Zell-Region (blending) beschriften. Generieren Sie das 3D-gerenderte Bild der gemischten Dämpfung Karte, um die 3D Verteilung der Toten Zelle Region visualisieren.

(6) Histologie und Immunhistochemie

Hinweis: Histologie und Immunhistochemie (IHC) gefärbten Bilder von Tumor Sphäroide ergeben sich um mit der entsprechenden OCT Ergebnisse korrelieren.

  1. Wählen Sie zu ausgewählten Zeitpunkten 1-2 Tumor Sphäroide aus Multi-well-Platte für Histologie und IHC beflecken. Mithilfe einer Pipette mit 1 mL-Pipettenspitzen der Sphäroid aus dem Brunnen zu einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen.
    Hinweis: Schneiden Sie die Pipettenspitze 1 mL vor der Übertragung zu gewährleisten, dass die Öffnung der Spitze größer als die Größe des Tumor-Sphäroid zu beschädigen die Struktur des Sphäroids ist.
  2. Jeder Tumor Sphäroid in einem einzigen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gefüllt mit 10 % Formaldehyd und Fix für 48 h zu sammeln.
  3. Führen Sie die Histologie und IHC Prozesse für jedes Sphäroid, mit standard Paraffin einbetten Techniken.
    Hinweis: Fleck 5 μm dicke Abschnitte des Tumors Sphäroide für Hämatoxylin und Eosin (H & E) und terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick Ende Kennzeichnung (TUNEL) Apoptose-Erkennung. Eine Gegenfärbung Hämatoxylin wird TUNEL. Eine digitale Dia-Scanners wurde verwendet, um Scannen die gefärbte Probe und erhalten hochauflösende histologische und IHC Bilder.

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Ergebnisse

Hoher Durchsatz optische Kohärenz Tomographie Bildgebung der Sphäroide in eine 96-Well-Platte

Abbildung 3 zeigt das Ergebnis der HT-OCT Abtastung einer 96-Well-Platte mit HCT-116 Tumor Sphäroide am 3. Tag. Sequentielle Scan der gesamten Platte beginnt aus dem rechten unteren Brunnen (H12). Abbildung 3 b zeigt das Flussdiagramm der Software-Implementierung des Systems der H...

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Diskussion

Tumor-Aktivität ist für seine morphologische Struktur äußerst relevant. Ähnlich wie bei der Überwachung der charakteristischen Wachstumskurve für 2D Zellkulturen, ist tracking die Wachstumskurve für 3D Tumor Sphäroide auch einen konventionellen Ansatz für das langfristige Sphäroid Wachstum Verhalten für verschiedene Zelllinien zu charakterisieren. Insbesondere können wir die Droge Antwort charakterisieren, durch die Analyse von Tumor-Abbau oder Tumor Regrowth spiegelt sich direkt in der Wachstumskurve. Quantitative Bewer...

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Offenlegungen

Die Autoren geben keine konkurrierenden Interesse.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NSF gewährt IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH Zuschüsse, R21EY026380, R15EB019704 und R01EB025209 und Lehigh University Gründerfonds.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Custom Spectral Domain OCT Imaging SystemEntwickelt in unserem Labor
Superlumineszenzdiode (SLD)ThorlabsSLD1325Lichtquelle
2&mal; 2 Singlemode-Faserkoppler mit Absicherung, 50:50 Splitting-VerhältnisAC PhotonicsWP13500202B201
Referenzarm
Lens TubeThorlabs
AdapterThorlabs
Kollimating LensThorlabsAC080-020-C
FokussierobjektivThorlabs
Kinematische SpiegelhalterungThorlabs
SpiegelThorlabs
1D TranslationstischThorlabs
Kontinuierlicher GraudichtefilterThorlabs
SockelstützeThorlabs
KlemmgabelThorlabs
Probenarm
LinsentubusThorlabs
AdapterThorlabs
KollimationslinseThorlabsAC080-020-C
GalvanometerThorlabs
RelaisobjektivThorlabsAC254-100-Czwei Relaisobjektive zum Aufbau eines Teleskops
Dreieck SpiegelhalterungThorlabs
SpiegelThorlabs
ObjektivMitutoyo
Sockel PfostenThorlabs
KlemmgabelThorlabs
PolarisationsreglerThorlabs
30mm KäfighalterungThorlabs
KäfigstangeThorlabs
Stage
3D motorisierter TranslationstischBeijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.
2D-Kipptisch-Rotations-Tischplattenhalter
3D-gedrucktes
Spektrometer
LinsenrohrThorlabs
AdapterThorlabs
KollimationslinseThorlabsAC080-020-C
Gitterrost WasatchG = 1145 lpmm
F-Theta-ObjektivThorlabsFTH-1064-100
InGaAs ZeilenkameraSensor UnbegrenztSU1024-LDH2
NameCompany<strong>Katalognummer Kommentare
Zellkulturkomponente
HCT 116 ZelllinieATCCCCL-247
ZellkulturflascheSPL Life Sciences70025
PipetteFisherbrand14388100
PipettenspitzenSorenson Bioscience10340
Gibco GlutaMax DMEMThermo Fisher Scientific10569044
Fötales Rinderserum, zertifiziert, US-HerkunftThermo Fisher Scientific16000044
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Corning 96-Well mit klarem Boden und ultraniedriger Bindung MikrotiterplatteCorning7007
Gibco PBS, pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0,5%)Thermo Fisher Scientific15400054
Forma Series II 3110 CO2-Inkubatoren mit WassermantelThermo Fisher Scientific3120
HandschuheVWR89428-750
ParafilmSigma-AldrichP7793
TransferpipettenGlobe Scientific138080
ZentrifugeEppendorf5702 RZum Zentrifugieren des 15 mL Röhrchens
ZentrifugeNUAIREAWEL CF 48-RZum Zentrifugieren des 96-Well-Plattenmikroskops
Olympus
Name<>UnternehmenKatalognummerKommentar
Histologie & IHC
Digitaler ObjektträgerscannerLeicaAperio AT2Hochauflösende histologische Bilder erhalten
Histologie-ServiceHistowizService für histologische und immunhistologische Färbung von Tumor-Sphäroiden anfordern
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Liste kommerzieller OCTs
SD-OCT SystemThorlabsTelesto Series
SD-OCT SystemWasatch PhotonicsWP OCT 1300 nm
NameCompany<strong>Katalognummer<>Comments
Software for Data Analyses
Basic Image AnalysisNIHImageJFiji funktioniert auch.
3D-RenderingThermo Fisher ScientificAmiraKommerzielle Software. Option 1
3D-RenderingBitplaneImarisKommerzielle Software. Möglichkeit 2. Wird in der
Protokoll-OCT-Erfassungssoftwarespeziell in C++ entwickelt wurde.
Stage ControlBeijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.MRC_3Integriert in den benutzerdefinierten OCT-Erfassungscode, eine
OCT-Verarbeitungssoftwarespeziell in C++ entwickelt wurde. GPU nutzen. Integriert in den benutzerdefinierten OCT-Erfassungscode.
Morphologische und physiologische Analysedie speziell in MATLAB entwickelt
JTH360XY: verwendet, die , die , wurde

Referenzen

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