نحن نقدم طريقة لتنقية والكشف وتحديد الببتيدات diGly التي تنشأ من البروتينات في كل مكان من عينات بيولوجية معقدة. الطريقة المعروضة قابلة للاستنساخ وقوية وتتفوق على الأساليب المنشورة فيما يتعلق بمستوى عمق تحليل كل يوم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التعديل بعد التحويل ية للبروتينات بواسطة البروتين الصغير في كلمكانفيا تشارك في العديد من الأحداث الخلوية. بعد الهضم الtryptic من البروتينات في كل مكان، يمكن استخدام الببتيدات مع بقايا diglycine مترافقة مع مجموعة أمينية إبسيلون من الليسين ('K-а-diglycine' أو ببساطة 'diGly') لتتبع موقع التعديل الأصلي. وقد أدى التنقية المناعية الفعالة من الببتيدات diGly جنبا إلى جنب مع الكشف الحساس عن طريق قياس الطيف الكتلي إلى زيادة كبيرة في عدد مواقع التعامي التي تم تحديدها حتى الآن. لقد قمنا بإجراء العديد من التحسينات على سير العمل هذا ، بما في ذلك تجزئة المرحلة العكسية عالية في عدم الاتصال بـ pH من الببتيدات قبل إجراء الإثراء ، وإدراج إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدمًا في متعدد القطب لتوجيه الأيون. أيضا، تنظيف أكثر كفاءة من العينة باستخدام المكونات القائمة على مرشح من أجل الاحتفاظ حبات الأجسام المضادة يؤدي إلى مزيد من التحديد للببتيدات diGly. هذه التحسينات تؤدي إلى الكشف الروتيني لأكثر من 23،000 الببتيدات diGly من خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (هيلا) التحلل على تثبيط البروتينفي الخلية. نظهر فعالية هذه الاستراتيجية للتحليل المتعمق لمحات كليوموكلوتينوم من عدة أنواع مختلفة من الخلايا وفي عينات الجسم الحي، مثل أنسجة الدماغ. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل انتشار البروتين للكشف عن كل يوم في كل مكان خلوي عميق.
المقدمة
اقتران ubiquitin إلى البروتينات علامات عليها لتدهور من قبل proteasome وهي عملية حاسمة في البروتوستاس. مجموعة C-المحطة الكاربوكسيلي من ubiquitin يشكل رابطة isopeptide مع مجموعة ليسين من البروتين المستهدف1,2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرفاق ubiquitin بوحدات ubiquitin الأخرى ، مما يؤدي إلى تشكيل هياكل بوليوبيكوتين متجانسة (أي K48 أو K11) أو متفرعة (أي غير متجانسة أو مختلطة) هياكل البوليوبيكوتين1،3. الوظيفة الأكثر شهرة من ubiquitin هو دوره في تدهور بروتياسومي، بوساطة polyubiquitin K48 المرتبطة. ومع ذلك ، فقد أصبح من الواضح أن كل من أحادية ، وكذلك polyubiquit....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على جميع الأساليب الموصوفة هنا التابعة لإيراسموس إم سي.
1. إعداد عينة
- الخلايا المثقفة
- حدد خط الخلية ذات الاهتمام (على سبيل المثال، HeLa أو خلايا العظام [U2OS] الخلايا) وتنمو الخلايا في جلبكو الحد الأدنى النسر المتوسطة (DMEM) تكملها حرارة 10٪ مصل البقر الجنين المنشط (FBS) و 100 وحدة / مل البنسلين / العقديات.
- لتجارب البروتيوميات الكمية، الخلايا الثقافية في DMEM تفتقر إلى أرجينين وليسين. يجب أن تستكمل المتوسطة مع 10٪ مصل البقري الجنيني dialyzed (FBS), 100 وحدة / مل البنسلين / العقديات, وألانين الجلوتامين. جعل نوعين من وسائل الإعلام عن طريق إضافة إما الليسين التق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
البروتينات في كل مكان ترك 114.04 دا بقايا diglycine على بقايا الليسين الهدف عندما يتم هضم البروتينات مع التربسين. تم استخدام الفرق الكتلي الناجم عن هذا الزخرف ة للتعرف بشكل لا لبس فيه على موقع التعامي في تجربة قياس الطيف الكتلي. الاستراتيجية التي نصفها هنا هي طريقة حديثة لإثراء وتحديد الببتيدات diGly اللاحقة بواسطة تدفق نانوي LC-MS /MS(الشكل 1A). في هذه الدراسة ، تم استخدام كل من الخلايا المستزرعة والمواد الفية للخلايا كمصدر بيولوجي للبروتينا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تطبيق البروتوكول الموصوف هنا على عينات من مصادر بيولوجية مختلفة، مثل الخلايا المستزرعة وفي أنسجة الجسم الحي. في جميع الحالات حددنا الآلاف من الببتيدات diGly، شريطة أن يكون إجمالي كمية مدخلات البروتين 1 ملغ على الأقل. الإثراء باستخدام أجسام مضادة محددة فعالة للغاية ، بالنظر إلى أنه تم تحديد الببتيدات المنخفضة جدا ً من الخلايا بأكملها 100-150 فقط من الخلايا بأكملها إذا لم يتم تطبيق إجراءات تخصيب للبروتينات المحددة في كل مكان أو الببتيدات diGly. ومن الواضح أن قياس الطيف الكتلي الحساس شرط مسبق للحصول على أعداد كبيرة من بط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
هذا العمل هو جزء من مشروع "البروتينات في العمل"، وهو برنامج للمركز الهولندي للبروتيوميات الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي كجزء من خارطة الطريق الوطنية على نطاق واسع مرافق البحوث (المشروع رقم 184.032.201 ).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1،4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl Discs | Supelco | 66883-U | المنتج توقف في Supelco; CDS Analytical هي الشركة المصنعة الجديدة (https://www.cdsanalytical.com/empore) فورمات |
| الأمونيوم | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 الراتنج ، 3.5 & mu ؛ م ، 130 & أرينج. | مياه | ||
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما ألدريتش | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF / F قابس مرشح | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine ، Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine - 8 (13C6; 15N2), Arginine-10 (13C6; 15< / sup>N4< / sub>) مختبرات | كامبريدج للنظائر | ||
| Lysyl Endopeptidase (LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| MPI لفرن | NanoLC ، MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos مطياف الكتلة | ThermoFisher | ||
| مجموعة فحص البروتين Pierce BCA | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µ م) جزيئات الطور المعكوسة البوليمرية | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-& epsilon ؛ -GG) Kit | تقنيات إشارات الخلية | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters WAT036790 | قم بإزالة مادة tC18 من الخرطوشة قبل ملء الخرطوشة ب PLRP-S | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| تريس بيس | سيجما-ألدريتش | T6066 | |
| تريس-هيدروكلوريك | سيجما-ألدريتش | T5941 | |
| تريبسين ، | TPCK ثيرموفيشر | 20233 |
المراجع
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
