Summary
Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.
Abstract
La modification posttranslationnelle des protéines par la petite ubiquitine protéique est impliquée dans de nombreux événements cellulaires. Après la digestion tryptique des protéines ubiquitinées, les peptides avec un reste de diglycine conjugués au groupe aminé d’epsilon de lysine ('K-'diglycine' ou simplement 'diGly') peuvent être utilisés pour suivre le site original de modification. L’immunopurification efficace des peptides diGly combinés à la détection sensible par spectrométrie de masse a entraîné une augmentation considérable du nombre de sites d’ubiquitination identifiés à jour. Nous avons apporté plusieurs améliorations à ce flux de travail, y compris la fractionnation hors ligne de la phase inverse de pH des peptides avant la procédure d’enrichissement, et l’inclusion de paramètres plus avancés de fragmentation de peptide dans le multipole de routage d’ion. En outre, un nettoyage plus efficace de l’échantillon à l’aide d’un bouchon filtré afin de conserver les perles d’anticorps entraîne une plus grande spécificité pour les peptides diGly. Ces améliorations ont comme conséquence la détection courante de plus de 23.000 peptides diGly des cellules cancéreuses humaines de cervical (HeLa) cellules lysates sur l’inhibition protéasome dans la cellule. Nous montrons l’efficacité de cette stratégie pour une analyse approfondie des profils ubiquitinome de plusieurs types de cellules et d’échantillons in vivo, tels que les tissus cérébraux. Cette étude présente un ajout original à la boîte à outils pour l’analyse d’ubiquitination des protéines pour découvrir l’ubiquitinome cellulaire profond.
Introduction
La conjugaison de l’ubiquitine aux protéines les marque pour la dégradation par le protéasome et est un processus crucial dans la protéostasie. Le groupe carboxyl C-terminal d’ubiquitine forme un lien isopeptide avec le groupe lysine 'amino de la protéine cible1,2. En outre, l’ubiquitine peut être attachée à d’autres modules d’ubiquitine, résultant en la formation de structures homogènes (c.-à-d., K48 ou K11) ou ramifiées (c.-à-d. hétérogènes ou mixtes) structures de polyubiquitine1,3. La fonction la plus connue de l’ubiquitine est son rôle dans la dégradation protéasomique, médiée par la polyubiquitine liée à K48. Cependant, il est devenu clair que la mono- ainsi que la polyubiquitination jouent également des rôles dans de nombreux processus qui sont indépendants de la dégradation par le protéasome. Par exemple, les chaînes liées au K63 ont des rôles non dégradants dans le trafic intracellulaire, la dégradation lysosomale, la signalisation de la kinase et la réponse des dommages d’ADN4,5. Les six autres types de liaison sont moins abondants et leurs rôles sont encore largement énigmatiques, bien que les premières indications sur leurs fonctions dans la cellule émergent, en grande partie en raison du développement de nouveaux outils pour permettre la détection spécifique à la liaison6,7.
La spectrométrie de masse est devenue un outil indispensable pour les analyses de protéome et de nos jours des milliers de protéines différentes de pratiquement n’importe quelle source biologique peuvent être identifiées dans une seule expérience. Une couche supplémentaire de complexité est présentée par des modifications posttranslationnelles (PTM) de protéines (p. ex., phosphorylation, méthylation, acétylation et ubiquitination) qui peuvent moduler l’activité protéique. L’identification à grande échelle des protéines porteuses de PTM a également été rendue possible par les développements dans le champ de spectrométrie de masse. La stoichiométrie relativement faible des peptides portant des SMPT par rapport à leurs homologues non modifiés présente un défi technique et des étapes d’enrichissement biochimique sont généralement nécessaires avant l’analyse de spectrométrie de masse. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs méthodes d’enrichissement spécifiques ont été développées pour l’analyse des MPT.
En raison des rôles multiformes de l’ubiquitination des protéines dans la cellule, il ya une grande demande pour le développement de méthodes analytiques pour la détection des sites d’ubiquitination sur les protéines8. L’application de méthodes spectrométriques de masse a conduit à une explosion du nombre de sites d’ubiquitination identifiés dans les protéines de mouche des fruits, souris, humains et levures9,10,11,12,13,14. Une étape majeure a été présentée par le développement de stratégies d’enrichissement basées sur l’immunoprécipitation au niveau du peptide à l’aide d’anticorps dirigés contre le motif de reste K-GG (également appelé «diglycine» ou «diGly»). Ces peptides diGly sont produits sur la digestion des protéines ubiquitinées utilisant la trypsine comme la protéase15,16.
Ici, nous présentons un flux de travail optimisé pour enrichir les peptides diGly à l’aide de l’immunopurification et de la détection ultérieure par spectrométrie de masse Orbitrap. À l’aide d’une combinaison de plusieurs modifications des flux de travail existants, en particulier dans les étapes de préparation de l’échantillon et de spectrométrie de masse, nous pouvons maintenant identifier systématiquement plus de 23 000 peptides diGly provenant d’un seul échantillon de cellules HeLa traitées avec un protéasome inhibiteur et 10 000 euros provenant de cellules HeLa non traitées. Nous avons appliqué ce protocole aux lysates de l’étiquetage isotopique non étiqueté et stable avec des acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) étiquetés cellules HeLa ainsi que pour des échantillons endogènes tels que le tissu cérébral.
Ce flux de travail présente un ajout précieux au répertoire d’outils pour l’analyse des sites d’ubiquitination afin de découvrir l’ubiquitinome profond. Le protocole suivant décrit en détail toutes les étapes du flux de travail.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (EDC) d’Erasmus MC.
1. Préparation de l’échantillon
- Cellules cultivées
- Sélectionnez une ligne d’intérêt cellulaire (p. ex. cellules HeLa ou ostéosarcome [U2OS]) et faites pousser les cellules du minimal Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco complétées par un sérum bovin foetal inactivé de 10 % et 100 unités/mL pénicilline/streptomycine.
- Pour les expériences quantitatives de protéomique, les cellules de culture dans le DMEM manquant d’arginine et de lysine. Le milieu doit être complété par le sérum bovin foetal (FBS) dialysé à 10 %, à 100 unités/mL pénicilline/streptomycine et à l’alanine-glutamine. Faire deux types de supports en ajoutant soit de la lysine conventionnelle et de l’arginine («Light' Medium) ou lysine-8(13C6; 15N2) et arginine-10 (13C6; 15N4) ('Heavy' Medium), respectivement.
- Les lots de cellules de culture dans Light Medium (c.-à-d. non étiqueté) et Heavy Medium (c.-à-d. étiquetés, SILAC) pour au moins six doubles avant l’expansion et le traitement pour s’assurer que toutes les protéines de la culture Heavy Medium sont étiquetées avec des isotopes lourds contenant acides aminés.
- Traiter les cellules pendant 8 h avec 10 m de bortezomib inhibiteur protéasome ou un volume équivalent de DMSO comme un traitement fictif. Laver les cellules avec PBS, les dissocier à l’aide de 1% trypsin/EDTA, et pelleter les cellules.
- Lyse la pastille de cellules d’une plaque de culture de 150 cm2 par condition testée dans 2 ml de tris-HCl de 50 mM glacé (pH à 8,2) avec 0,5 % de désoxycholate de sodium (DOC). Faire bouillir le lysate à 95 oC pendant 5 min et sonicate pendant 10 min (réglage "H" pour le sonicateur inscrit dans la Table des Matériaux) à 4 oC. Nous ne recommandons pas l’utilisation d’inhibiteurs de la désubiquitinase tels que N-ethylmaleimide (NEM), parce que cela peut introduire des modifications protéiques indésirables qui peuvent compliquer l’identification peptide.
- Tissu cérébral de souris in vivo
- Lors de l’utilisation du tissu in vivo, lyse le tissu dans un tampon glacé contenant 100 mM Tris-HCl (pH - 8,5), 12 mM de sodium DOC, et 12 mM sodium N-lauroylsarcosinate17. Sonicate le lysate pendant 10 min (réglage "H" pour le sonicateur inscrit dans la Table des Matériaux) à 4 oC et faire bouillir le lysate pendant 5 min à 95 oC.
- Quantifier la quantité totale de protéines à l’aide d’un kit d’analyse de protéines BCA d’absorption colorimétrique. La quantité totale de protéines devrait être d’au moins plusieurs milligrammes pour une immunoprécipitation de peptide diGly réussie (IP). Pour les expériences SILAC mélanger les protéines étiquetées légères et lourdes dans un rapport de 1:1 basé sur la quantité totale de protéines.
- Réduire toutes les protéines à l’aide de 5 mM 1,4-dithiothreitol pendant 30 min à 50 oC et ensuite les alkyler avec 10 mM d’iodoacetamide pendant 15 min dans l’obscurité. Effectuez la digestion des protéines avec Lys-C (rapport enzyme-substrat) pendant 4 h suivi d’une digestion de nuit avec trypsine (rapport enzyme-substrat) à 30 oC ou à température ambiante (RT).
- Ajouter l’acide trifluorocéacique (TFA) à l’échantillon digéré à une concentration finale de 0,5 % et le centrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min afin de précipiter et d’enlever tout détergent. Recueillir le supernatant contenant les peptides pour fractionnement ultérieur.
2. Fractionnement hors ligne de peptide
- Utilisez une chromatographie C18 à pH à haute teneur en pH (RP) avec un matériau de phase stationnaire polymérique (300 ' , 50 m; voir Tableau des matériaux) chargé dans une cartouche de colonne vide pour fractionner les peptides tryptiques. La taille du lit de phase stationnaire doit être ajustée à la quantité de protéine digeste pour être fractionnée. Préparer une cartouche vide de colonne de 6 ml (voir Tableau des matériaux)remplie de 0,5 g de matériaux de phase stationnaire pour 10 mg de digestion des protéines. Le rapport de phase de digestion des protéines à la phase stationnaire devrait être d’environ 1:50 (w/w).
- Chargez les peptides sur la colonne préparée et lavez la colonne avec environ 10 volumes de colonnes de 0,1 % DTT, suivis d’environ 10 volumes de colonnes de H2O.
- Elute les peptides en trois fractions avec 10 volumes de colonnes de 10 mm ammonium formate solution (pH - 10) avec 7%, 13,5%, et 50% d’acétonitrile (AcN), respectivement. Lyophiliser toutes les fractions à l’exhaustivité.
- Utilisez des anticorps de motif résiduif d’ubiquitine (K-GG) conjugués à la protéine A perles d’agarose pour l’immunoenrichment des peptides diGly. Étant donné que la quantité exacte d’anticorps par lot de perles est une information exclusive et non divulguée par le fabricant, il est recommandé d’utiliser la même définition pour un lot de perles que le fabricant afin d’éviter toute confusion. Laver un lot de ces perles 2x avec PBS et diviser la boue de perle en six fractions égales. Voir la figure 1 pour un schéma expérimental détaillé.
- Dissoudre les trois fractions de peptide recueillies à l’étape 2,3 en 1,4 ml d’un tampon composé de 50 mM MOPS, 10 m de phosphate de sodium et 50 m NaCl (pH - 7,2), et faire tourner les débris.
- Ajouter les supernatants des fractions aux perles d’anticorps diGly et incuber pendant 2 h à 4 oC sur une unité de rotateur. Baisser les perles et transférer le supernatant dans un nouveau lot de perles d’anticorps et incuber à nouveau pendant 2 h à 4 oC.
- Stockez les supernatants pour l’analyse ultérieure du protéome mondial (GP).
- Transférer les perles de chaque fraction dans une pointe de pipette de 200 L équipée d’un bouchon de filtre GF/F pour conserver les perles. Placez la pointe de la pipette avec les perles dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL équipé d’un adaptateur de pointe de centrifugeuse. Laver les perles 3x avec 200 L de tampon IAP glacé et par la suite 3x avec 200 'L de glace-froid milliQ H2O. Tourner vers le bas de la colonne à 200 x g pendant 2 minutes avant chaque étape de lavage, mais veillez à ne pas laisser la colonne s’épuiser. Elute les peptides en utilisant 2 cycles de 50 L de 0,15% TFA.
- Desalt les peptides à l’aide d’une pointe d’étape C18 (essentiellement une pointe de pipette de 200 L avec deux disques C18) et les sécher à l’exhaustivité à l’aide de centrifugation sous vide.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Effectuez des expériences LC-MS/MS sur un spectromètre de masse sensible couplé à un système de nanoflow LC.
- Utilisez une colonne en phase inversée de 50 cm emballée à l’interne avec un diamètre intérieur de 75 m rempli de résine CSH130 (3,5 m, 130 euros) et elute les peptides avec un gradient de 2 à 28% (AcN, 0,1% FA) sur 120 min à 300 nL/min. Alternativement, utilisez des colonnes LC disponibles dans le commerce avec des propriétés similaires. Gardez la colonne à 50 oC à l’aide d’un four à colonnes, par exemple (voir Tableau des matériaux).
- Effectuez l’analyse de spectrométrie de masse.
- Le spectromètre de masse doit être actionné en mode d’acquisition (DDA) dépendant des données. Les spectres de masse MS1 doivent être collectés à haute résolution (p. ex., 120 000), avec un objectif automatisé de contrôle du gain (AGC) de 4E5 et un délai d’injection maximal de 50 ms en cas de spectromètre de masse Orbitrap.
- Effectuez d’abord l’analyse de spectrométrie de masse en mode « Intensité la plus élevée d’abord ». De cette façon, l’ion le plus intense est sélectionné d’abord pour la fragmentation, puis le deuxième plus élevé, et ainsi de suite, en utilisant la méthode de vitesse de pointe avec un temps de cycle total de 3 s. Par la suite, effectuez une deuxième série d’analyse de la SP DDA en mode « Intensité la plus basse d’abord », de sorte que l’ion le moins intense soit sélectionnée d’abord, puis la deuxième plus basse, et ainsi de suite. Cette stratégie assure une détection optimale des peptides d’abundance très faible.
- Filtrer les ions précurseurs en fonction de leurs états de charge (2-7 charges) et l’affectation de pointe monoisotopic. Exclure dynamiquement les précurseurs interrogés précédemment pour les précurseurs de peptide de 60 s. Isoler avec un filtre de masse quadrupole réglé sur une largeur de 1,6 Th.
- Recueillir des spectres MS2 dans le piège à ions à un AGC de 7E3 avec un temps d’injection maximum de 50 ms et HCD énergie de collision de 30%.
4. Analyse des données
- Analyser les fichiers bruts spectrométrie de masse à l’aide d’un moteur de recherche approprié tel que la suite logicielle MaxQuant librement disponible basée sur le moteur de recherche Andromède18,19. Dans MaxQuant, sélectionnez les paramètres par défaut avec quelques adaptations qui sont indiquées ci-dessous. Réglez la spécificité de l’enzyme à la trypsine, avec le nombre maximum de clivages manqués portés à trois. Placez la lysine avec un reste diGly (114,04 Da), oxydation de la méthionine et de l’acétylation N-terminale comme modifications variables, et définissez la carbamidomethylation de la cystéine comme modification fixe.
- Effectuez des recherches dans les bases de données contre un fichier FASTA contenant des séquences de protéines téléchargées à partir, par exemple, du référentiel Uniprot (https://www.uniprot.org/downloads) combiné à un leurre et à une base de données standard commune sur les contaminants qui est automatiquement fournie par MaxQuant. Définissez le taux de découverte de faux (FDR) à 1 % et fixez le score minimum pour les peptides modifiés (diGly) à 40 (valeur par défaut). Exclure les peptides identifiés avec un résidu de lysine modifié par le C-terminal de façon diGly de l’analyse.
- Pour l’analyse quantitative des fichiers d’expérience SILAC, définissez la multiplicité à « 2 » et répétez l’étape 4.2.
- Effectuez toutes les analyses en aval (p. ex., statistiques, analyses d’ontologie des gènes) avec le modulePersée 20 de la suite logicielle MaxQuant.
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Representative Results
Les protéines ubiquitinées laissent un reste de diglycine de 114,04 Da sur les résidus de lysine cible lorsque les protéines sont digérées avec de la trypsine. La différence de masse causée par ce motif a été utilisée pour reconnaître sans ambiguïté le site de l’ubiquitination dans une expérience de spectrométrie de masse. La stratégie que nous décrivons ici est une méthode de pointe pour l’enrichissement et l’identification subséquente des peptides diGly par nanoflow LC-MS/MS(figure 1A). Dans cette étude, les cellules cultivées et le matériel in vivo ont été utilisés comme source biologique de protéines, mais ce protocole est compatible avec n’importe quelle source de protéines. Suivant les étapes du protocole, il devrait être simple d’identifier 10 000 à 25 000 peptides diGly de 2 à 20 mg d’apport de protéines. Pour augmenter l’étendue de l’ubiquitination des protéines dans les cellules, un inhibiteur protéasome tel que le bortétéomène ou MG132 peut être ajouté quelques heures avant la récolte des cellules. Si aucun inhibiteur protéasome n’a été utilisé, le nombre de peptides diGly identifiés a eu tendance à être significativement plus faible (30-40%).
Nous avons apporté plusieurs améliorations aux protocoles existants. Tout d’abord, une fractionnement brute en trois fractions basée sur la chromatographie de phase inversée et l’elution subséquente à un pH élevé est effectuée pour réduire la complexité du mélange de peptide. Ces fractions montrent un chevauchement très faible dans les identifications de peptide, et un nombre comparable de peptides diGly devrait être identifié par fraction(figure 2). Il en résulte un grand nombre de peptides diGly uniques identifiés dans chacune de ces fractions. Fait important, l’une des fractions (généralement la seconde) devrait contenir le propre peptide de diGly de ubiquitin K48 modifié LIFAGK (GG)QLEDGR (m/z 730.39). C’est de loin le peptide le plus abondant de la fraction immunoprécipitée et se caractérise par le pic intense et large du chromatogramme LC(figure 1B). Il s’agit d’un pic chromagraphique de référence et s’il est absent du chromatogramme, l’IP a probablement échoué.
Une autre amélioration est l’adaptation de la procédure d’analyse DDA est le multipole de routage d’ion dans le spectromètre de masse. Dans le top conventionnel N data-dependent acquisition (DDA), N pics du spectre MS1 sont sélectionnés pour la fragmentation. Ce schéma de fragmentation commence avec le pic d’intensité le plus élevé d’abord, suivi par le pic de deuxième plus haute intensité, et ainsi de suite. Dans un schéma de fragmentation alternatif, le pic le moins intense est choisi en premier, suivi du deuxième pic le moins intense, etc. La raison d’être de cet ordre de sélection est qu’il y a suffisamment de temps pour fragmenter les peptides abondants très faibles ainsi. En fait, nous avons constaté que le nombre d’identifications de peptides augmente lorsque les « premières » et les « premières » courses de PDD étaient combinées comparativement à une analyse LC-MS en double avec des paramètres standard de PDD (c.-à-d. les plus élevés en premier). Pour un profilage ubiquitinome plus complet, il est donc recommandé de combiner les pistes LC-MS avec des régimes de fragmentation « les plus élevés d’abord » et les « premiers » les plus faibles dans la procédure d’analyse des données. Cette stratégie « la plus basse d’abord » peut produire plus de 4 000 peptides diGly uniques, qui n’ont pas été détectés lorsque seul le régime conventionnel du PDD a été utilisé(figure 2).
Enfin, les IP supplémentaires de la durée de circulation après la première ADRESSE peuvent produire un autre peptides diGly unique(figure 2).
Les articles dans la littérature sur le profilage d’ubiquitination rapportent typiquement environ 10.000 peptides diGly identifiés12,21. Ici, de tous les peptides diGly identifiés sur trois écrans biologiques de réplique, 'gt;9,000 étaient présents dans les trois, tandis que 'gt;17,000 étaient présents dans au moins deux sur trois répliques (figure 3). Typiquement, en suivant le protocole décrit ici, on devrait identifier les peptides diGly uniques d’un échantillon de protéine de 15-20 mg à l’aide d’un lot standard de perles d’anticorps CST. En termes de pureté et de sélectivité, le rapport entre les peptides diGly identifiés et les peptides non modifiés devrait toujours être de 0,5 . Le nombre d’identifications de peptide diGly dépendait fortement de la quantité de matériel d’entrée de protéine. Une adresse IP effectuée avec seulement 1 mg de matériel d’entrée a produit environ 2.500 identifications de peptide diGly, tandis qu’avec 10 mg de matériel d’entrée de protéine -gt;15,000 identifications de peptide diGly ont été produites. Le tableau 1 énumère le nombre prévu de peptides diGly identifiés pour chaque condition. Il convient de noter que ces chiffres ne sont que des estimations et dépendent du type de spectromètre de masse utilisé. La figure 4 montre le chevauchement entre les identifications de peptide diGly avec des quantités faibles, moyennes et élevées de matériel d’entrée.
Afin d’illustrer la valeur ajoutée des améliorations pour l’analyse du site d’ubiquitination décrite ci-dessus, nous avons également effectué une analyse ubiquitinomique quantitative des cellules HeLa étiquetées SILAC qui ont été traitées avec le bortéomique protéasome comparé aux cellules de contrôle non traitées dans un essai d’échange d’étiquettes en double. Plus de la moitié (-gt;55%) de tous les peptides identifiés dans l’eluate sur IP étaient des peptides diGly. Plus de 19 000 peptides diGly uniques ont été identifiés, ce qui n’est qu’un peu moins que dans un échantillon non étiqueté PAR le SILAC. La raison en est peut-être la complexité plus élevée des spectres MS1 dans un essai SILAC en raison de la présence de paires de pics de peptide. Dans l’analyse siLAC, des différences relativement importantes ont été observées entre les nombres de peptides diGly qui ont été identifiés exclusivement dans l’état avancé (c.-à-d. cellules traitées par bortezomib dans le canal lourd, cellules témoins dans le canal lumineux) et celles exclusivement identifiées dans l’état inverse (c.-à-d. les cellules traitées par bortézomib dans le canal lumineux, cellules témoins dans le canal lourd), dans ce cas 1 752 contre 6 356(tableau supplémentaire 1). Lors de l’utilisation du logiciel MaxQuant en mode « multiplicité 2 » (c.-à-d. SILAC à deux canaux), 7 555 peptides diGly ont été identifiés avec une intensité nulle dans le canal lourd (pratiquement tous venant dans l’expérience inverse) et une valeur d’intensité non nulle dans le canal lumineux. En revanche, aucun peptides diGly simple n’a été identifié avec une valeur d’intensité non-zéro dans le canal lourd accompagné d’une valeur d’intensité zéro dans le canal léger. Quand une analyse de MaxQuant sur le même ensemble de données a été exécutée dans le mode « multiplicité 1 » avec la moiety diGly et l’acide aminé étiqueté combiné en une seule modification variable, beaucoup de variantes lourdes de peptide diGly ont été identifiées, même quand aucune contrepartie légère de ce peptide n’a pu être détectée. L’explication la plus probable est l’incapacité du logiciel à faire face à l’identification des peptides diGly qui sont exclusivement présents dans le canal lourd. Ce phénomène est susceptible de se produire largement, parce que l’inhibition du protéasome déclenchera la formation de nouveaux sites d’ubiquitination. Le fait de cocher la case à cocher d’option « requantifier » max., qui a été développée pour traiter ces questions et qui devrait corriger cette question, semble insuffisant pour éviter complètement cette question. Évidemment, la grande majorité des peptides diGly sont en cours d’éréglementation ou formé de novo sur l’inhibition protéasome, parce que plus des deux tiers de la piscine de peptide ont des ratios H:L d’au moins 1,5 (figure 5B).
Enfin, nous avons appliqué cette méthode d’analyse du site d’ubiquitination à un échantillon de tissu in vivo. Pour évaluer l’efficacité, nous avons extrait environ 32 mg de protéines du cerveau frais de souris (10 % du poids des tissus humides est une protéine). Le matériau de cerveau n’a pas été traité avec des inhibiteurs protéasome ou n’importe quel autre réactif qui pourrait amplifier l’ubiquitination globale de protéine. À partir de cet échantillon, 10 871 peptides diGly uniques ont été identifiés(tableau supplémentaire 2). Tous les peptides diGly identifiés dans ce tissu provenaient des emplacements endogènes de l’ubiquitination dans une situation stable-état. Aucun traitement n’a été imposé pour stimuler l’ubiquitination mondiale (p. ex., inhibition du protéasome). Nous émettons donc l’hypothèse que ces sites d’ubiquitination proviennent au moins partiellement de (poly)ubiquitination impliquée dans des événements de signalisation cellulaire non protéasome négociés, qui est en accord avec les idées proposées dans la littérature5,16,22.
En conclusion, la méthode décrite ici permet l’exploration approfondie de l’ubiquitinome d’une manière reproductible. Pour un aperçu des résultats typiques obtenus avec cette procédure voir Van Der Wal et al.23.
Figure 1 : Aperçu expérimental. (A) Aperçu de l’approche expérimentale. Des échantillons ont été préparés, trypsinisés et fractionnés en trois fractions utilisant la chromatographie de phase inverse avec l’elution élevée de pH. Un lot de perles commerciales d’anticorps peptide a été divisé en six fractions égales et les trois fractions de peptide ont ensuite été chargées sur trois des fractions de perles. Les peptides diGly ont été immunopurifiés, elfés, et recueillis, et le flowthrough a été plus tard transféré aux trois fractions restantes de perles fraîches. Les peptides diGly recueillis ont été analysés par spectrométrie de masse sur un spectromètre de masse Lumos Orbitrap selon un schéma à deux niveaux combinant un cycle dans lequel les pics les plus intenses ont d’abord été sélectionnés pour la fragmentation du peptide et le cycle suivant dans lequel les pics les moins intenses ont été sélectionnés en premier. L’ensemble complet des courses nLC-MS/MS a ensuite été analysé à l’aide de MaxQuant. (B) L’une des fractions devrait contenir le propre peptide de diGly de ubiquitin K48 modifié LIFAGK (GG)QLEDGR (m/z 730.39). C’est de loin le peptide le plus abondant dans la fraction immunoprécipitée et a été caractérisé par le pic intense et large dans le chromatogramme de LC entre 50-55 min sur un gradient de 120 min. Si ce pic de référence est absent du chromatogramme, la propriété intellectuelle a probablement échoué. Ce chiffre a été modifié à partir de Van Der Wal et al.23. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Nombre de peptides diGly détectés pour chacune des trois étapes d’amélioration. (A) Effet de fractionnement brut avant l’immunoprécipitation. Le chevauchement entre les populations de peptides diGly identifiées dans les trois fractions distinctes est montré. (B) Effet des première et deuxième étapes d’incubation. (C) Résultats du régime ajusté de fragmentation des peptides. Ce chiffre a été modifié à partir de Van Der Wal et al.23. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Peptides diGly détectés dans trois répliques biologiques des cellules traitées par bortezomib montrant la quantité de chevauchement entre les courses. Ce chiffre a été modifié à partir de Van Der Wal et al.23. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Chevauchement des peptides diGly identifiés provenant d’analyses ayant de faibles (4 mg), moyennes (10 mg) et des quantités d’intrants totales élevées (40 mg). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Détection de peptides diGly dans les cellules étiquetées SILAC. (A) Nombres de peptides détectés dans les conditions avant et inverse des cellules HeLa étiquetées SILAC pour les réglages multiplicité 1 et 2. (B) Scatterplot of diGly peptide SILAC ratios in Bortezomib (Btz) treated HeLa cells. Seuls les peptides qui ont été identifiés et quantifiés dans les expériences avant et inverse sont montrés. Ce chiffre a été modifié à partir de Van Der Wal et al.23. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Condition | Quantité de matériel d’entrée (mg) | Nombre prévu de peptides diGly identifiés |
| Cellules HeLa non traitées | 10 | 7,500 |
| Inhibiteur protéasome traité cellules HeLa | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | 25 000 euros | |
| Tissu (cerveau de souris) | 30 | 10 000 euros |
Tableau 1 : Nombre prévu d’identifications de peptide diGly pour différentes conditions. Ces chiffres ne sont que des estimations et dépendent des paramètres expérimentaux utilisés.
Tableau supplémentaire 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).
Tableau supplémentaire 2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).
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Discussion
Le protocole décrit ici a été appliqué à des échantillons provenant de diverses sources biologiques, telles que les cellules cultivées et le tissu in vivo. Dans tous les cas, nous avons identifié des milliers de peptides diGly, à condition que la quantité totale d’entrée de protéine était au moins 1 mg. L’enrichissement à l’aide d’anticorps spécifiques est très efficace, étant donné que seulement au plus 100-150 peptides diGly abondants très bas ont été identifiés à partir de lysates cellulaires entiers si aucune procédure d’enrichissement pour les protéines ubiquitinées ou peptides diGly ont été appliquées. De toute évidence, la spectrométrie de masse sensible est une condition préalable pour obtenir un grand nombre d’identifications diGly. Bien que nous ayons utilisé avec succès plusieurs spectromètres de masse différents, nous avons trouvé que l’Orbitrap Tribrid Lumos était le plus sensible qui donnait les rendements les plus élevés.
La chromatographie hors ligne de RP avec l’elution de pH élevée doit être testée avant que les IP soient exécutés. Le chevauchement entre les fractions en termes d’identifications de peptide devrait être aussi faible que possible pour une expérience optimale. Après la propriété intellectuelle, l’une des fractions devrait contenir le propre peptide de diGly de 28 Kubiquitin LIFAGK (GG)QLEDGR (m/z 730.39). C’est de loin le peptide le plus abondant de la fraction immunoprécipitée et se caractérise par le pic intense et large du chromatogramme LC entre 50-55 min sur un gradient de 120 min(figure 1B). Si ce pic de référence est absent du chromatogramme, la propriété intellectuelle a probablement échoué.
Il est important d’analyser les peptides tryptiques diGly immunoprécipitated immédiatement après la procédure de propriété intellectuelle, de sorte que le temps entre la propriété intellectuelle et l’analyse doit être maintenu au minimum. Pendant ce temps, les peptides doivent de préférence être stockés dans une fiole de verre au lieu de tubes en plastique. Laisser les peptides dans des tubes en plastique trop longtemps, soit à RT ou à -20 oC, peut entraîner des précipitations de peptides et/ou coller à la paroi du tube en plastique. Cela aura finalement une incidence sur la sensibilité de l’analyse.
Bien qu’il y ait eu des rapports dans la littérature au sujet de l’interprétation erronée potentielle des adducts d’iodoacetamide comme des emplacements d’ubiquitination en raison de leurs mouvements identiques de masse de 114.04 Da24,nous n’avons trouvé aucune indication de ceci avec nos préparations des peptides tryptiques immunoprécipités. Tout d’abord, les effets secondaires de l’utilisation de l’iodoacetamide (IAM) sont minimes dans nos mains en utilisant le protocole d’alkylation-réduction décrit ci-dessus. Deuxièmement, l’anticorps est spécifique pour les peptides avec un reste de diglycine. Peptides avec deux moieties iodoacetamide covalentement ajoutés aux résidus de lysine ne devraient pas être enrichis dans ce protocole. Troisièmement, la majorité des peptides de la fraction immunoprécipitée sont régulés à l’inhibition protéasome, comme en témoigne l’expérience SILAC décrite ci-dessus(figure 5). Puisque la population des protéines ubiquitinées est affectée à la suite de ce traitement, il est fortement probable que ces peptides affectés soient en effet des peptides diGly résultant des protéines ubiquitinées.
Enfin, ce protocole pourrait être utilisé en combinaison avec une stratégie quantitative multiplexed récemment publiée à l’aide de TMT19. Évidemment, bien que les nombres de peptides diGly publiés soient légèrement inférieurs à ceux obtenus à l’aide du protocole actuel, la capacité de quantifier relativement jusqu’à 16 échantillons simultanément est un énorme avantage. La combinaison de ces méthodes permettra aux chercheurs d’effectuer des études quantitatives à grande échelle en matière d’ubiquitinome en profondeur.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux s’ursent dans le cadre du projet "Proteins at Work", un programme du Centre de protéomique des Pays-Bas financé par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) dans le cadre des installations nationales de recherche à grande échelle (projet numéro 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
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