Summary
Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.
Abstract
La modifica post-traduzionale delle proteine da parte della piccola ubiquitina proteica è coinvolta in molti eventi cellulari. Dopo la digestione trittica delle proteine ubiquitinate, i peptidi con un residuo di diglycine coniugato al gruppo di amminomido epsilon della lisina ('K-z-diglycine' o semplicemente 'diGly') possono essere utilizzati per rintracciare il sito di modifica originale. L'immunopurificazione efficiente dei peptidi diGly combinata con il rilevamento sensibile mediante spettrometria di massa ha portato a un enorme aumento del numero di siti di ubiquitinazione identificati fino ad oggi. Abbiamo apportato diversi miglioramenti a questo flusso di lavoro, tra cui la frazione offline ad alta fase inversa di peptidi prima della procedura di arricchimento e l'inclusione di impostazioni di frammentazione peptide più avanzate nel multipolo di routing io. Inoltre, la pulizia più efficiente del campione utilizzando un tappo basato su filtro al fine di mantenere le perline anticorpali si traduce in una maggiore specificità per i peptidi diGly. Questi miglioramenti si traducono nella rilevazione di routine di più di 23.000 peptidi diGly da cellule tumorali cervicali umane (HeLa) lismi cellulari su inibizione proteasoso nella cellula. Mostriamo l'efficacia di questa strategia per un'analisi approfondita dei profili ubiquitinomi di diversi tipi di cellule e di campioni in vivo, come il tessuto cerebrale. Questo studio presenta un'originale aggiunta alla cassetta degli attrezzi per l'analisi dell'ubiquitinazione delle proteine per scoprire l'ubiquitimo cellulare profondo.
Introduction
La coniugazione dell'ubiquitina alle proteine le segna per la degradazione da parte del proteasome ed è un processo cruciale nella proteostasi. Il gruppo carboxyl c-terminale di ubiquitina forma un legame isopeptide con la lisina-aminogruppo della proteina bersaglio1,2. Inoltre, l'ubiquitina può essere collegata ad altri moduli di ubiquitina, con conseguente formazione di strutture omogenee (cioè, K48 o K11) o ramificate (cioè strutture di polianiquitina eterogenee o miste)1,3. La funzione più nota dell'ubiquitina è il suo ruolo nella degradazione proteasomica, mediato dalla poliubiquitina legata al K48. Tuttavia, è diventato chiaro che sia la mono- che la poliubiquitinazione svolgono anche ruoli in molti processi che sono indipendenti dalla degradazione da parte del proteasome. Per esempio, le catene legate al K63 hanno ruoli non degradanti nel traffico intracellulare, nella degradazione lsosomica, nella segnalazione della chinasi e nella risposta al danno del DNA4,5. Gli altri sei tipi di collegamento sono meno abbondanti e i loro ruoli sono ancora in gran parte enigmatici, anche se stanno emergendo le prime indicazioni sulle loro funzioni nella cellula, in gran parte a causa dello sviluppo di nuovi strumenti per consentire il rilevamento specifico del collegamento6,7.
La spettrometria di massa è diventata uno strumento indispensabile per le analisi del proteoma e al giorno d'oggi migliaia di proteine diverse da praticamente qualsiasi fonte biologica possono essere identificate in un singolo esperimento. Un ulteriore strato di complessità è presentato da modifiche post-traduzionali (PTM) di proteine (ad esempio, fosforolalazione, metilazione, acetilazione e ubiquitinazione) che possono modulare l'attività delle proteine. L'identificazione su larga scala delle proteine che portano il PTM è stata resa possibile anche dagli sviluppi nel campo della spettrometria di massa. La stoichiometria relativamente bassa dei peptidi con PTM rispetto alle loro controparti non modificate presenta una sfida tecnica e le fasi di arricchimento biochimico sono generalmente necessarie prima dell'analisi della spettrometria di massa. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati diversi metodi di arricchimento specifici per l'analisi dei PTM.
A causa dei molteplici ruoli dell'ubiquitinazione proteica nella cellula, c'è una grande domanda per lo sviluppo di metodi analitici per il rilevamento di siti di ubiquitinazione sulle proteine8. L'applicazione di metodi spettrometrici di massa ha portato ad un'esplosione del numero di siti di ubiquitinazione identificati nelle proteine della mosca della frutta, del topo, dell'uomo e del lievito9,10,11,12,13,14. Un passo importante è stato rappresentato dallo sviluppo di strategie di arricchimento basate sull'immunoprecipitazioni a livello di peptide utilizzando anticorpi diretti contro il motivo residuo di K-e-GG (chiamato anche 'diglycine' o 'diGly'). Questi peptidi diGly sono prodotti sulla digestione di proteine ubiquitinate utilizzando la trypsina come proteasi15,16.
Qui, presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato per arricchire per peptidi diGly utilizzando l'immunopurificazione e la successiva rilevazione da parte della spettrometria di massa Orbitrap. Utilizzando una combinazione di diverse modifiche dei flussi di lavoro esistenti, specialmente nelle fasi di preparazione del campione e spettrometria di massa, ora possiamo identificare regolarmente più di 23.000 peptidi diGly da un singolo campione di cellule HeLa trattate con un proteasome inibitore e 10.000 dollari da cellule HeLa non trattate. Abbiamo applicato questo protocollo a lisati sia da etichettatura isotoma sia non etichettata che stabile con aminoacidi nella coltura cellulare (SILAC) etichettati cellule HeLa così come a campioni endogeni come il tessuto cerebrale.
Questo flusso di lavoro presenta una preziosa aggiunta al repertorio di strumenti per l'analisi dei siti di ubiquitinazione al fine di scoprire il profondo ubiquitinome. Il protocollo seguente descrive in dettaglio tutti i passaggi del flusso di lavoro.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) di Erasmus MC.
1. Preparazione del campione
- Cellule coltivate
- Selezionare una linea di interesse cellulare (ad esempio, cellule HeLa o osteosarcoma [U2OS]) e far crescere le cellule nel Minimal Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e 100 unità/mL penicillina/streptomica.
- Per gli esperimenti di proteomica quantitativa, le cellule di coltura nel DMEM mancano di arginina e lisina. Il mezzo deve essere integrato con 10% siero bovino fetale dial (FBS), 100 unità/mL penicillina/streptomicina e alanina-glutamina. Fare due tipi di supporti aggiungendo lisina convenzionale e arginina ('Medio leggero' o lisina-8 (13C6; 15N2) e arginina-10 (13C6; 15N4) ('Pesante' Medio), rispettivamente.
- Gruppi di colture di cellule in Medium chiaro (cioè senza etichetta) e Medium pesante (cioè, etichettato, SILAC) per almeno sei raddoppi prima dell'espansione e del trattamento per assicurarsi che tutte le proteine nella coltura di Medium pesante siano etichettate con isotopo stabile pesante contenenti Aminoacidi.
- Trattare le cellule per 8 h con 10 m dell'inibitore proteasoso bortezomib o un volume equivalente di DMSO come trattamento fittizio. Lavare le cellule con PBS, dissociarle utilizzando l'1% di trypsin/EDTA e pellet le cellule.
- Lyse il pellet cellulare da una piastra di coltura 150 cm2 per condizione testata in 2 mL di ghiaccio-freddo 50 mM Tris-HCl (pH - 8,2) con 0.5% deoxycholate di sodio (DOC). Far bollire il lisato a 95 gradi centigradi per 5 min e sonicare per 10 min (impostando "H" per il sonicatore elencato nella Tabella dei Materiali) a 4 gradi centigradi. Non raccomandiamo l'uso di inibitori della deubiquitinasi come N-ethylmaleimide (NEM), perché questo può introdurre modifiche proteiche indesiderate che possono complicare l'identificazione dei peptidi.
- Tessuto cerebrale del topo in vivo
- Quando si utilizza tessuto in vivo, lisciviare il tessuto in un tampone ghiacciato contenente 100 mM Tris-HCl (pH - 8,5), 12 mM di sodio DOC e 12 mM di sodio N-lauroylsarcosinate17. Sonicare il lisato per 10 min (impostando "H" per il sonicatore elencato nella tabella dei materiali) a 4 gradi centigradi e far bollire il lisato per 5 min a 95 gradi centigradi.
- Quantifica la quantità totale di proteine utilizzando un kit di saggio proteico BCA a assorbimento colorimetrico. La quantità totale di proteine dovrebbe essere di almeno diversi milligrammi per un'immunoprecipitazioni peptide diGly di successo (IP). Per gli esperimenti SILAC si mescolano le proteine etichettate leggere e pesanti in un rapporto 1:1 in base alla quantità totale di proteine.
- Ridurre tutte le proteine utilizzando 5 mM 1,4-dithiothreitol per 30 min a 50 gradi centigradi e successivamente alchilarle con 10 mM di iodoacetamide per 15 min al buio. Eseguire la digestione proteica con Illys-C (rapporto 1:200 enzima-substrato) per 4 h seguita da digestione notturna con trypsina (1:50 rapporto enzima-substrato) a 30 gradi centigradi o a temperatura ambiente (RT).
- Aggiungere l'acido trifluoroacetico (TFA) al campione digerito ad una concentrazione finale dello 0,5% e centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 min al fine di precipitare e rimuovere tutto il detersivo. Raccogliere il supernatante contenente i peptidi per la frazione successiva.
2. Frazione di peptidi offline
- Utilizzare la cromatografia C18 del pH (Rp) alta con materiale polimerico di fase stazionaria (300 , 50 m; vedi Tabella dei materiali) caricato in una cartuccia a colonna vuota per frazionare i peptidi tryptici. La dimensione del letto della fase stazionaria deve essere regolata in base alla quantità di proteina digerire da frazionare. Preparare una cartuccia vuota a colonna da 6 mL (vedi Tabella dei materiali)riempita con 0,5 g di materiale di fase stazionario per 10 mg di digestione proteica. Il rapporto tra proteina e ditore di fase stazionaria dovrebbe essere di circa 1:50 (w/w).
- Caricare i peptidi sulla colonna preparata e lavare la colonna con circa 10 volumi di colonna dello 0,1% TFA, seguiti da circa 10 volumi di colonna di H2O.
- Elutare i peptidi in tre frazioni con 10 volumi di colonna di 10 mM di soluzione di formato di ammonio (pH - 10) con 7%, 13.5% e 50% acetonitrile (AcN), rispettivamente. Lyophilize tutte le frazioni alla completezza.
- Usa gli anticorpi del motivo residuo dell'ubiquitina (K-z-GG) coniugati alle proteine A agarose per l'immunoarricchimento dei peptidi diGly. Poiché l'esatta quantità di anticorpo per lotto di perline è informazioni proprietarie e non divulgate dal produttore, si consiglia di utilizzare la stessa definizione per un lotto di perline come il produttore fa al fine di evitare confusione. Lavare un lotto di queste perline 2x con PBS e dividere il liquame di perline in sei frazioni uguali. Vedere Figura 1 per un sistema sperimentale dettagliato.
- Sciogliere le tre frazioni di peptide raccolte nel passaggio 2,3 in 1,4 mL di un buffer composto da 50 MM MOPS, 10 mM di fosdio di sodio e 50 mM NaCl (pH 7,2), e far girare verso il basso i detriti.
- Aggiungere i supernatanti delle frazioni alle perle anticorpali diGly e incubare per 2 h a 4 gradi centigradi su un'unità rotatore. Girare verso il basso le perline e trasferire il supernatante in un nuovo lotto di perline anticorpali e incubare di nuovo per 2 h a 4 gradi centigradi.
- Memorizzare i supernatanti per la successiva analisi del proteoma globale (GP).
- Trasferire le perline da ogni frazione in una punta di pipetta da 200 luna dotata di una spina di filtro GF/F per conservare le perline. Mettere la punta della pipetta con le perline in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml dotato di adattatore per la centralità. Lavare le perline 3x con 200 l di tampone IAP ghiacciato e successivamente 3x con 200 l di milliQ H2O. Ruotare la colonna a 200 x g per 2 min prima di ogni fase di lavaggio, ma fare attenzione a non far asciugare la colonna. Elute i peptidi usando 2 cicli di 50 -L di 0,15% TFA.
- Disalare i peptidi utilizzando una punta dello stadio C18 (essenzialmente una punta di pipetta da 200 lun con due dischi C18) e asciugarli fino alla completezza utilizzando la centrifugazione sottovuoto.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Eseguire esperimenti LC-MS/MS su uno spettrometro di massa sensibile accoppiato a un sistema LC a nanoflusso.
- Utilizzate una colonna in-casa di 50 cm in fase invertita di 50 cm con un diametro interno di 75 m imballato con resina CSH130 (3,5 m, 130) ed eluse i tidi con un gradiente del 2-28% (AcN, 0,1% FA) su 120 min a 300 nL/min. In alternativa, utilizzare colonne LC disponibili in commercio con proprietà simili. Mantenere la colonna a 50 gradi centigradi utilizzando un forno a colonna, ad esempio (vedere Tabella dei materiali).
- Eseguire l'analisi della spettrometria di massa.
- Lo spettrometro di massa deve essere azionato in modalità Diacquisizione dipendente dai dati (DDA). Gli spettri di massa MS1 devono essere raccolti ad alta risoluzione (ad esempio, 120.000), con un'impostazione di destinazione automatica del controllo del guadagno (AGC) di 4E5 e un tempo massimo di iniezione di 50 ms in caso di spettrometro di massa Orbitrap.
- Eseguire prima l'analisi della spettrometria di massa in modalità "Intensità massima prima". In questo modo, lo ione più intenso viene selezionato prima per la frammentazione, poi il secondo più alto, e così via, utilizzando il metodo della velocità massima con un tempo di ciclo totale di 3 s. Successivamente, eseguire un secondo round di analisi DDA MS in modalità "Intensità più bassa prima", in modo che lo ione meno intenso viene selezionato prima, poi il secondo più basso, e così via. Questa strategia garantisce un rilevamento ottimale di peptidi di adessidia molto bassa.
- Filtrare gli ioni precursori in base agli stati di carica (2-7 cariche) e l'assegnazione di picco monoisotopico. Escludere i precursori precedentemente interrogati in modo dinamico per 60 s. Isolare i precursori di peptidi con un filtro di massa quadrupolo impostato su una larghezza di 1,6 Th.
- Raccogliere gli spettri MS2 nella trappola iotaria a un AGC di 7E3 con un tempo massimo di iniezione di 50 ms e un'energia di collisione HCD del 30%.
4. Analisi dei dati
- Analizzare i file raw spettrometria di massa utilizzando un motore di ricerca appropriato come la suite software MaxQuant liberamente disponibile basata sul motore di ricerca Andromeda18,19. In MaxQuant, selezionare le impostazioni predefinite con alcune adattamenti indicate di seguito. Impostare la specificità dell'enzima su trypsin, con il numero massimo di scissioni mancati elevato a tre. Impostare l'acesiglia con un residuo diGly (114.04 Da), ossidazione della methionina e n-terminal e impostare la carbamidomethylation di cisteina come una modifica fissa.
- Eseguire ricerche nel database su un file FASTA contenente sequenze proteiche scaricate, ad esempio, dal repository Uniprot (https://www.uniprot.org/downloads) combinato con un'esca e un database contaminanti comune standard fornito automaticamente da MaxQuant. Impostare il tasso di individuazione falsa (FDR) su 1% e impostare il punteggio minimo per i peptidi modificati (diGly) su 40 (valore predefinito). Escludere i peptidi identificati con un residuo di lisina modificato con diG del terminale C da ulteriori analisi.
- Per l'analisi quantitativa dei file dell'esperimento SILAC, impostare la molteplicità su "2" e ripetere il passaggio 4.2.
- Eseguire tutte le analisi a valle (ad esempio, statistiche, analisi geniali) con il modulo Perseus20 della suite software MaxQuant.
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Representative Results
Le proteine ubiquitinate lasciano un residuo di diglicina 114.04 Da sul residuo lisina bersaglio quando le proteine vengono digerite con la trypsina. La differenza di massa causata da questo motivo è stata usata per riconoscere inmodo inequivocabile il sito di ubiquitinazione in un esperimento di spettrometria di massa. La strategia che qui descriviamo è un metodo all'avanguardia per l'arricchimento e la successiva identificazione dei peptidi diGly da parte del nanoflusso LC-MS/MS (Figura 1A). In questo studio, sia le cellule coltivate che il materiale in vivo sono stati utilizzati come fonte biologica di proteine, ma questo protocollo è compatibile con qualsiasi fonte di proteine. Seguendo i passaggi del protocollo dovrebbe essere semplice identificare 10.000-25.000 peptidi diGly da 2-20 mg di ingresso proteico. Per aumentare l'estensione dell'ubiquitinazione proteica nelle cellule, un inibitore proteasoso come bortezomib o MG132 può essere aggiunto poche ore prima della raccolta delle cellule. Se non è stato utilizzato alcun inibitore proteaso, il numero di peptidi identificati diGly tendeva ad essere significativamente più basso (30-40%).
Abbiamo apportato diversi miglioramenti ai protocolli esistenti. In primo luogo, viene eseguita una frazione grezza in tre frazioni basate sulla cromatografia a fase invertita e sulla successiva eluizione ad alta pH per ridurre la complessità della miscela di peptidi. Queste frazioni mostrano una sovrapposizione molto bassa nelle identificazioni dei peptidi e dovrebbero essere identificati numeri comparabili di peptidi diGly per frazione (Figura 2). Questo si traduce in un elevato numero di peptidi diGly unici identificati in ciascuna di queste frazioni. È importante sottolineare che una delle frazioni (in genere la seconda) deve contenere il digtico tryptic diGly peptide lIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) modificato di ubiquitina. Questo è di gran lunga il peptide più abbondante nella frazione immunoprecipitata ed è caratterizzato dal picco intenso e largo nel cromatogramma LC (Figura 1B). Questo è un picco cromatografico di riferimento e se è assente dal cromatogramma l'IP è stato molto probabilmente infruttuoso.
Un altro miglioramento è l'adattamento della procedura di analisi DDA è il multipolo di instradamento iotone nello spettrometro di massa. Nell'acquisizione convenzionale n dipendente dai dati (DDA), i picchi N dello spettro MS1 sono selezionati per la frammentazione. Questo schema di frammentazione inizia prima con il picco di intensità più alta, seguito dal picco della seconda intensità più alta e così via. In uno schema di frammentazione alternativo, il picco meno intenso viene selezionato per primo, seguito dal secondo picco meno intenso, ecc. La logica alla base di questo ordine di selezione è che ci sia tempo sufficiente per frammentare anche peptidi abbondanti molto bassi. Infatti, abbiamo scoperto che il numero di identificazioni di peptidi aumenta quando le corse DDA "più alte prime" e "più basse prima" sono state combinate rispetto a un'analisi LC-MS duplicata con impostazioni DDA standard (cioè, prima la più alta). Per una profilazione onnitecnica più completa, si raccomanda pertanto di combinare le esecuzioni LC-MS con regimi di frammentazione "primo più alto" e "primo più basso" nella procedura di analisi dei dati. Questa strategia "più basso prima" può produrre più di 4.000 ulteriori peptidi diGly unici, che non sono stati rilevati quando è stato utilizzato solo il regime DDA convenzionale (Figura 2).
Infine, ip aggiuntivi del flusso attraverso dopo il primo IP in grado di produrre un altro 2.500 peptidi diGly unici da 2.500 dollari (Figura 2).
Gli articoli della letteratura sulla profilazione dell'ubiquitinazione riportano in genere circa 10.000 peptidi diGly identificati12,21. Qui, di tutti i peptidi diGly identificati su tre schermi di replica biologica, >9,000 erano presenti in tutti e tre, mentre >17.000 erano presenti in almeno due repliche su tre (Figura 3). Tipicamente, seguendo il protocollo descritto qui si dovrebbe identificare >21,000 peptidi diGly unici da un campione di proteine 15-20 mg utilizzando un lotto standard di perline anticorpali CST. In termini di purezza e selettività, il rapporto tra peptidi diGly identificati e peptidi non modificati dovrebbe sempre essere >0.5. Il numero di identificazioni di peptidi diGly dipendeva fortemente dalla quantità di materiale di input proteico. Un IP eseguito con solo 1 mg di materiale di input ha prodotto circa 2.500 identificazioni di peptidi di diG, mentre con 10 mg di materiale di input proteico >15,000 identificazioni peptide diGly sono stati prodotti. La tabella 1 elenca il numero previsto di peptidi diGly identificati per ogni condizione. Va notato che questi numeri sono solo stime e dipendono dal tipo di spettrometro di massa utilizzato. La figura 4 mostra la sovrapposizione tra le identificazioni dei peptidi diGly con quantità di materiale di input basso, medio e elevato.
Per illustrare il valore aggiunto dei miglioramenti per l'analisi del sito di ubiquitinazione descritti in precedenza, abbiamo anche eseguito un'analisi quantitativa onnipresente delle cellule HeLa con etichetta SILAC che sono state trattate con l'inibitore proteasome bortezomib rispetto alle cellule di controllo non trattate in un saggio di scambio di etichette duplicate. Più della metà (>55%) di tutti i peptidi identificati nell'eluato su IP erano peptidi diGly. Sono stati identificati oltre 19.000 peptidi diGly unici, che è solo leggermente inferiore rispetto a un campione con etichetta non-SILAC. La ragione di questo può essere la maggiore complessità degli spettri MS1 in un saggio SILAC a causa della presenza di coppie di picco peptide. Nell'analisi SILAC sono state osservate differenze relativamente grandi tra il numero di peptidi diGly che sono stati identificati esclusivamente nella condizione di avanzamento (cioè, bortezomib trattavano le cellule nel canale pesante, le cellule di controllo nel canale luminoso) e quelle identificate esclusivamente nella condizione inversa (cioè le cellule trattate bortezomib nel canale luminoso, le cellule di controllo nel canale pesante), in questo caso 1.752 contro 6.356 (Tabella supplementare 1). Durante l'utilizzo del software MaxQuant in modalità "molteplicità n. 2" (cioè SILAC a due canali), 7.555 peptidi diGly sono stati identificati con intensità zero nel canale pesante (praticamente tutti in arrivo nell'esperimento inverso) e un valore di intensità non zero nel canale leggero. Al contrario, nessun singolo peptide diGly è stato identificato con un valore di intensità diverso da zero nel canale pesante accompagnato da un valore di intensità zero nel canale luminoso. Quando un'analisi MaxQuant sullo stesso set di dati è stata eseguita in modalità "multiplicità 1" con la moiety diGly e l'amminoacido etichettato combinati in una singola modifica variabile, sono state identificate molte varianti pesanti diGly peptide, anche quando non è stata rilevata alcuna controparte leggera di quel peptide. La spiegazione più probabile per questo è l'incapacità del software di far fronte con l'identificazione di peptidi diGly che sono presenti esclusivamente nel canale pesante. Questo fenomeno è probabile che si verifichi ampiamente, perché l'inibizione del proteasoso inattiverà la formazione di nuovi siti di ubiquitinazione. Spuntando la casella di controllo dell'opzione "riquanti" in MaxQuant, che è stato sviluppato per affrontare questi problemi e dovrebbe risolvere questo problema, sembra essere insufficiente per evitare questo problema completamente. Ovviamente, la maggior parte dei peptidi diGly sono stati upregulated o formati de novo sulla base di inibizione proteasoso, perché oltre due terzi del pool di peptidi hanno rapporti H:L di almeno 1,5 (Figura 5B).
Infine, abbiamo applicato questo metodo di analisi del sito di ubiquitinazione a un campione di tessuto in vivo. Per valutare l'efficacia, abbiamo estratto circa 32 mg di proteine dal cervello di topo fresco (10% del peso del tessuto bagnato è proteina). Il materiale cerebrale non è stato trattato con inibitori proteasosi o qualsiasi altro reagente che potrebbe aumentare l'ubiquitenza proteica complessiva. Da questo esempio sono stati identificati 10.871 peptidi diGly univoci (Tabella supplementare 2). Tutti i peptidi diGly identificati in questo tessuto hanno avuto origine da siti endogeni di ubiquitinazione in una situazione stabile. Non è stato imposto alcun trattamento per aumentare l'ubiquitenza globale (ad esempio, l'inibizione proteasosa). Ipotizziamo quindi che questi siti di ubiquitinazione provengano almeno in parte da (polio)ubiquitinazione coinvolti in eventi di segnalazione cellulare mediati non proteasome, che è in accordo con le idee proposte nella letteratura5,16,22.
In conclusione, il metodo qui descritto consente l'esplorazione approfondita dell'onnipresente in modo riproducibile. Per una panoramica dei risultati tipici ottenuti con questa procedura si veda Van Der Wal etal.
Figura 1: Panoramica sperimentale. (A) Panoramica dell'approccio sperimentale. I campioni sono stati preparati, trippsinizzati e frazionati in tre frazioni utilizzando la cromatografia a fase inversa con elevata eluzione di pH. Un lotto di perline commerciali di anticorpi peptidi è stato diviso in sei frazioni uguali e le tre frazioni di peptidi sono state poi caricate su tre delle frazioni di perline. I peptidi diGly sono stati immunopuri, eluiti e raccolti, e il flusso è stato successivamente trasferito alle tre frazioni di perline fresche rimanenti. I peptidi diGly raccolti sono stati analizzati dalla spettrometria di massa su uno spettrometro di massa Lumos Orbitrap secondo uno schema a due livelli che combina un ciclo in cui i picchi più intensi sono stati selezionati per la prima volta per la frammentazione e il ciclo successivo in cui sono stati selezionati per primi i picchi di peptide meno intensi. Il set completo di esecuzioni nLC-MS/MS è stato quindi analizzato utilizzando MaxQuant. (B) Una delle frazioni dovrebbe contenere il k48 modificato trittico l'IFapcE LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39). Questo è di gran lunga il peptide più abbondante nella frazione immunoprecipitata ed è stato caratterizzato dal picco intenso e largo nel cromatogramma LC tra 50-55 min su un gradiente di 120 min. Se questo picco di riferimento è assente dal cromatogramma, il PI è stato molto probabilmente infruttuoso. Questa cifra è stata modificata da Van Der Wal et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Numero di peptidi diGly rilevati per ciascuna delle tre fasi di miglioramento. (A) Effetto della frazione grezza prima dell'immunoprecipitazioni. Viene mostrata la sovrapposizione tra le popolazioni di peptidi identificate nelle tre frazioni separate. (B) Effetto della prima e della seconda procedura di incubazione. (C) Risultati del regime di frammentazione del peptide rettificato. Questa cifra è stata modificata da Van Der Wal et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Peptidi DiGly rilevati in tre repliche biologiche di cellule trattate bortezomib che mostrano la quantità di sovrapposizione tra le corse. Questa cifra è stata modificata da Van Der Wal et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sovrapposizione dei peptidi diGly identificati da analisi con quantità di ingresso proteiche basse (4 mg), medie (10 mg) e elevate (40 mg) di ingresso proteico totale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rilevamento di peptidi diGly nelle cellule etichettate SILAC. (A) I numeri di peptidi rilevati nelle condizioni avanti e inversa del SILAC hanno etichettato le celle HeLa per le impostazioni di molteplicità 1 e 2. (B) Grafico a dispersione dei rapporti SILAC diGly peptidi nel trattamento delle cellule HeLa di Bortezomib (Btz). Vengono mostrati solo i peptidi che sono stati identificati e quantificati in esperimenti sia in avanti che in verseta. Questa cifra è stata modificata da Van Der Wal et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Condizione | Quantità di materiale di input (mg) | Numero previsto di peptidi diGly identificati |
| Cellule HeLa non trattate | 10 | 7,500 |
| L'inibitore proteasoso ha trattato le cellule HeLa | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25.000 | |
| Tessuto (cervello del topo) | 30 | >10.000 |
Tabella 1: Numero previsto di identificazioni di peptidi che si aspettano per diverse condizioni. Questi numeri sono solo stime e dipendono dalle impostazioni sperimentali utilizzate.
Tabella supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Tabella supplementare 2. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Il protocollo qui descritto è stato applicato a campioni provenienti da varie fonti biologiche, come cellule coltivate e tessuto in vivo. In tutti i casi abbiamo identificato migliaia di peptidi diGly, a condizione che la quantità totale di ingresso proteica fosse di almeno 1 mg. L'arricchimento con anticorpi specifici è altamente efficiente, dato che solo al massimo 100-150 peptidi diGly molto bassi sono stati identificati da lismi a tutta cellula se non sono state applicate procedure di arricchimento per proteine ubiquitanate o peptidi diGly. Ovviamente, la spettrometria di massa sensibile è un prerequisito per ottenere un numero elevato di identificazioni diGly. Anche se abbiamo utilizzato con successo diversi spettrometri di massa, abbiamo trovato l'Orbitrap Tribrid Lumos come il più sensibile che ha dato le rese più alte.
La cromatografia RP offline con elevata eluizione di pH deve essere testata prima dell'IP. La sovrapposizione tra le frazioni in termini di identificazione dei peptidi dovrebbe essere il più bassa possibile per un esperimento ottimale. Dopo il IP, una delle frazioni dovrebbe contenere il K48 modificato triptica diGly peptide LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39). Questo è di gran lunga il peptide più abbondante nella frazione immunoprecipitata ed è caratterizzato dal picco intenso e largo nel cromatogramma LC tra 50-55 min su un gradiente di 120 min (Figura 1B). Se questo picco di riferimento è assente dal cromatogramma, l'IP è stato molto probabilmente infruttuoso.
È importante analizzare i peptidi diGly tryptici immunoprecipitati immediatamente dopo la procedura IP, quindi il tempo tra il IP e l'analisi deve essere ridotto al minimo. Durante questo periodo, i peptidi dovrebbero preferibilmente essere conservati in una fiala di vetro invece di tubi di plastica. Lasciare i peptidi in tubi di plastica per troppo tempo, a RT o a -20 gradi centigradi, può provocare precipitazioni di peptidi e/o attaccarsi alla parete del tubo di plastica. Ciò influirà in ultima analisi sulla sensibilità dell'analisi.
Anche se ci sono state segnalazioni in letteratura sulla potenziale errata interpretazione degli addotti iodoacetamide come siti di ubiquitinazione a causa dei loro identici 114.04 Da spostamenti di massa24, non abbiamo trovato alcuna indicazione di questo con i nostri preparati viziati di peptidi triptici immunoprecipitati. In primo luogo, gli effetti collaterali dell'utilizzo di iodoacetamide (IAM) sono minimi nelle nostre mani utilizzando il protocollo di riduzione dell'alchilazione descritto sopra. In secondo luogo, l'anticorpo è specifico per i peptidi con un residuo di diglicina. I peptidi con due moieties iodoacetamide con covalente aggiunti ai residui di lisina non dovrebbero essere arricchiti in questo protocollo. In terzo luogo, la maggior parte dei peptidi nella frazione immunoprecipitata sono upregolati in base all'inibizione proteasoso, come esemplificato nell'esperimento SILAC descritto in precedenza (Figura 5). Poiché la popolazione di proteine ubiquitanate è colpita da questo trattamento, è altamente probabile che questi peptidi colpiti siano infatti peptidi diGly derivanti da proteine ubiquitinate.
Infine, questo protocollo potrebbe essere utilizzato in combinazione con una strategia quantitativa multiplexed pubblicata di recente utilizzando TMT19. Ovviamente, anche se il numero di peptidi pubblicato diGly è leggermente inferiore a quello ottenuto utilizzando il protocollo attuale, la capacità di quantificare relativamente fino a 16 campioni contemporaneamente è un enorme vantaggio. La combinazione di questi metodi consentirà ai ricercatori di eseguire studi oniquinomici quantitativi su larga scala in grande profondità.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro fa parte del progetto "Proteins at Work", un programma del Centro di Proteomica dei Paesi Bassi finanziato dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) nell'ambito della National Roadmap Large-Scale Research Facilities (numero di progetto 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
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