CRISPR Cas は植物や動物の複雑なゲノムをエンジニア リングする強力な技術です。ここでは、我々 は異なる Ca 酵素を使用して人間のゲノムを効率的に編集するためのプロトコルを詳しく説明します。我々 は、重要な考慮事項と編集の効率を最適化する設計パラメーターを強調表示します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
クラスター化された定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) システムは細菌の適応免疫の自然機能が、用途が正常に変更されて多くの異なる生物のゲノム工学のため。最も一般的に、または CRISPR 関連 9 (Cas9) または非相同末端結合 (NHEJ) 経路や相同性監督の修理 (を介して修理する DNA 二本鎖切断後、ゲノムの特定のサイトを切断するために使用 Cas12a エンドヌクレアーゼドナーのテンプレートがあるかによって HDR) 経路は、不在またはそれぞれ現在です。日には、哺乳類細胞でゲノムの編集を実行できるように細菌の異なる種から CRISPR システムを示されています。ただし、技術の見かけのシンプルさにもかかわらず複数の設計パラメーター必要があります考慮する頻繁のゲノム実験を編集を行う最高について当惑のユーザーを残して。ここでは、ゲノムを実験哺乳類セルラインでの編集が正常に実行を容易にする目的で、必要な DNA の変更を運ぶ細胞クローンの同定実験の設計から完全なワークフローを記述します。CRISPR システム、スペーサーの長さ、および単一座礁させた分野 (ssODN) ドナー テンプレートのデザインの選択など、メモを取るユーザーの重要な考慮事項を強調表示します。このワークフローは、遺伝子ノックアウト研究、疾患モデルの作業、役に立つでしょうか、記者の生成細胞を思い描いてください。
概要
すべての生きている有機体のゲノムをエンジニア リングすることで、病原の補正など、多くの医学・ バイオ テクノロジー アプリケーションの突然変異、病気の研究、正確な細胞モデルの構築や農業の生成望ましい特徴を持つ作物。世紀の変わり目以来は、哺乳類セルの meganucleases1,2,3を含むゲノム工学の様々 な技術が開発されて、亜鉛指の核酸の4、5、または転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs)6,7,8,9。ただし、これらの以前のテクノロジは、プログラムすることは困難または組み立て、退屈な研究と業界での普及を阻害します。
近年では、クラスター化された定期的に空間短い回文繰り返し (CRISPR) - CRISPR 関連 (Cas) システムは、強力な新しいゲノム工学技術
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. sgRNAs の設計
- 適切な CRISPR Cas システムを選択します。
- まず、哺乳類細胞16, 21-32で機能することが示されているすべての Cas9 と Cas12a の核酸分解酵素の PAM シーケンスの対象地域を確認します。5 つの頻繁に使用される酵素は、一緒に彼らのそれぞれの PAMs表 1に与えられています。
注: 酵素以外にも哺乳類セル同様、連鎖球菌サーモフィルス(St1Cas9) から Cas9 ヌクレアーゼなど正常にデプロイされて他の使用頻度の低い Ca 酵素は表 1に示すことPAM NNAGAAW を認識しています。目的のターゲット サイトに知られている PAM が含まれていないゲノム工学に CRISPR Cas システムを使用できません 1 つがでしょう。 - 第二に、ターゲットの genomic 位置または遺伝子の既知のプロパティを検討してください。遺伝子発現やクロマチン アクセシビリティに考慮するいくつかのプロパティが含まれます、シーケンスにもあるかどうか他の密接に関連します。
注: 特定の酵素特定の生物学的コンテキストに適しています。たとえば、反復的な genomic 位置またはその他のいくつかの近い paralogs で遺伝子を編集する勧めします (SpCas9 や LbCas12a よりも、sgRNA とターゲット D....
- まず、哺乳類細胞16, 21-32で機能することが示されているすべての Cas9 と Cas12a の核酸分解酵素の PAM シーケンスの対象地域を確認します。5 つの頻繁に使用される酵素は、一緒に彼らのそれぞれの PAMs表 1に与えられています。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
ゲノムの実験では、クローンを作成する必要があります興味の軌跡 sgRNA ターゲットを表現する CRISPR プラスミドを編集を実行します。最初に、プラスミッドはそれをリニア化する (通常型酵素) 制限の酵素と消化されます。完全および部分的な消化を区別する未消化プラスミドと一緒に 1% の agarose のゲルの消化の製品を解決することをお勧めします。未消化のプラスミドはスーパー、線形化された対応する (図 7を参照) よりも速く走る傾向があります。第二に、sgRNA の 2 つのオリゴヌクレオチドがアニールしカットのプラスミッドに。オリゴヌクレオチドが正常に CRISPR プラスミドのバックボーンにクローニングされているかどうかを確認するのには、(図 7b参照) コロニー PCR が実行されます。肯定的なクローンがプラスミッドが抽出され、サンガーの送信前に接種し、シーケンス。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
CRISPR Cas システムは、エンジニアのゲノムおよびトランスクリプトームの植物や動物に強力な革新的な技術です。CRISPR Cas システムでは、ゲノム、トランスクリプトーム解析目的44をエンジニア リングの適応が可能性があるを含む多くの菌種が見つかっています。化膿連鎖球菌(SpCas9) から Cas9 エンドヌクレアーゼが他の細菌由来の酵素細胞21,22,23,24日に正常に展開するのに最初の酵素表 1に示すように、種は、人間16,26,27,
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は競争を持っていない金銭的な利益。
謝辞
M.H.T. は、科学技術と研究の共同協議会事務所の助成金 (1431AFG103) のための代理店でサポートされて、国立医療研究評議会は、(OFIRG/0017/2016) を付与、国立研究財団補助金 (046-NRF2013-THE001 ・ NRF2013-THE001-093)、教育層 1 の省許可 (RG50/17 (S))、スタートアップは、ナンヤン工科大学、南洋工科大学から国際遺伝子工学機械 (iGEM) 競争のための資金から付与します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK) | NEB | M0201 | |
| ビアルカリホスファターゼ(rSAP) | NEB | M0371 | |
| トリス-アセテート-EDTA(TAE)バッファー、50X | 1st Base | BUF-3000-50X4L | 使用前に1倍に希釈してください。1X 溶液には、40 mM Tris、20 mM 酢酸、および 1 mM EDTA が含まれています。 |
| Tris-EDTA(TE)バッファー、10X | 1st Base | BUF-3020-10X4L | 使用前に1倍に希釈してください。1X 溶液には、10 mM Tris(pH 8.0)と 1 mM EDTAが含まれています。 |
| BbsI | NEB | R0539 | |
| BsmBI | NEB | R0580 | |
| T4 DNAリガーゼ | NEB | M0202 | 400,000ユニット/ml |
| クイックライゲーションキット | NEB | M2200 | T4 DNAリガーゼの代替品です。 |
| Rapid DNA Ligation Kit | Thermo Scientific | K1423 | T4 DNAリガーゼの代替品です。 |
| Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット | Thermo Scientific | 451245 | この塩溶液は、キットにTOPOベクターが付属しています。 |
| NEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックスNEB | E2621L | ギブソンアセンブリ用キット。 | |
| ワンショットSTBL3化学的に有能な大腸菌 | サーモサイエンティフィック | C737303 | |
| LBブロス(レノックス)、粉末 | シグマアルドリッチ | L3022 | ddH20で再構成し、オートクレーブ使用前に |
| LBブロスと寒天(レノックス)、粉末 | シグマアルドリッチ | L2897 | ddH20で再構成し、使用前にオートクレーブ |
| SOC培地 | - | - | 2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、20 mM グルコース、1 L の LB ブロス |
| アンピシリン (ナトリウム)、USP グレード | ゴールド バイオテクノロジー | A-301 | |
| REDiant 2X PCR Mastermix | 1st Base | BIO-5185 | |
| アガロース | 1st Base | BIO-1000 | |
| T7 エンドヌクレアーゼ I | NEB | M0302 | |
| プラスミド DNA 抽出 Miniprep Kit | Favorgen | FAPDE 300 | |
| ダルベッコ修正イーグルミディアム (DMEM)、高グルコース | Hyclone | SH30081.01 | 4.5 g/L グルコース、L-グルタミンなし、HEPES およびピルビン酸ナトリウム |
| L-グルタミン、200mM | Gibco | 25030 | |
| ペニシリン - ストレプトマイシン、10、000U/mL | Gibco | 15140 | |
| 0.25% トリプシン EDTA、1X | Gibco | 25200 | |
| ウシ胎児血清 | Hyclone | SV30160 | FBS は、56 oC で 30 分間 |
| リン酸緩衝生理食塩水、1X | Gibco | 20012 | |
| jetPRIME トランスフェクション試薬 | Polyplus Transfection | 114-75 | |
| QuickExtract DNA 抽出液、1.0 | Epicenter | LUCG-QE09050 | |
| ISOLATE II ゲノム DNA キット | バイオラインで使用前に熱不活性化されます。 | BIO-52067 | QuickExtract |
| Q5 High-Fidelity DNA ポリメラーゼ | NEB | M0491 | |
| デオキシヌクレオチド (dNTP) 溶液ミックス | NEB | N0447 | |
| 6X DNA ローディング色素 | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% ブロモフェノールブルー、0.03% キシレンシアノール FF、60% グリセロール、60 mM EDTA |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル、Set3 | Merck | ||
| ニトロセルロースメンブレン、0.2µm | バイオ・ラッド | 1620112 | |
| Tris-glycine-SDS バッファー、10X | Bio-Rad | 1610772 | 使用前に 1X に希釈してください。1x溶液には、25 mMトリス、192 mMグリシン、および0.1%SDSが含まれています。 |
| トリスグリシン緩衝液、10X | 1st base | BUF-2020 | 使用前に1倍に希釈してください。1x溶液には、25 mMトリスと192 mMグリシンが含まれています。 |
| Ponceau S solution | Sigma Aldrich | P7170 | |
| TBS, 20X | 1st base | BUF-3030 | 使用前に 1X に希釈してください。1x溶液には、25 mM Tris-HCl(pH 7.5)と150 mM NaClが含まれています。 |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Skim Milk for immunoassay | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
| WesternBright Sirius-femtogram HRP | Advansta | K12043 | |
| 抗体 β-actin (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | ロット番号: C0916 |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop分光光度計 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit蛍光光度計 | Thermo Scientific | Q33226 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Scientific | AMF4300 | |
| CRISPRプラスミド:pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | シングルベクターシステム:gRNAは同じプラスミドから発現します。 |
| CRISPRプラスミド:pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | シングルベクターシステム:gRNAは同じプラスミドから発現します。 |
| CRISPRプラスミド:xCas9 3.7 Addgene 108379 | デュアルベクターシステム:gRNAは異なるプラスミドから発現します。 | ||
| CRISPRプラスミド:pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | シングルベクターシステム:gRNAは同じプラスミドから発現します。 |
| CRISPRプラスミド:hCas9 | Addgene | 41815 | デュアルベクターシステム:gRNAは異なるプラスミドから発現されます。 |
| CRISPRプラスミド:eSpCas9(1.1) | Addgene | 71814 | シングルベクターシステム:gRNAは同じプラスミドから発現します。 |
| CRISPRプラスミド:VP12(SpCas9-HF1) | Addgene | 72247 | デュアルベクターシステム:gRNAは異なるプラスミドから発現します。 |
参考文献
- Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
- Arnould, S., et al.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
