Dette manuskript beskriver en enkel metode til at måle stress Behavioral hos voksne zebrafisk. Tilgangen udnytter den medfødte tendens, at: zebrafisk foretrækker den nederste halvdel af en tank, når den er i en stresset tilstand. Vi beskriver også metoder til at sammenkoble analysen med farmakologi.
Reagerer hensigtsmæssigt på stressende stimuli er afgørende for overlevelse af en organisme. Omfattende forskning er blevet udført på et bredt spektrum af stress-relaterede sygdomme og psykiske lidelser, men endnu yderligere undersøgelser af den genetiske og neuronal regulering af stress er stadig nødvendige for at udvikle bedre terapeutisk. Den: zebrafisk giver en kraftfuld genetisk model til at undersøge neurale fundament af stress, da der findes en stor samling af mutante og transgene linjer. Desuden, farmakologi kan nemt anvendes til zebrafish, som de fleste stoffer kan tilsættes direkte til vand. Vi beskriver her brugen af ‘ roman tank test ‘ som en metode til at studere medfødte stress reaktioner i zebrafish, og demonstrere, hvordan potentielle angstdæmpende medicin kan valideres ved hjælp af analysen. Metoden kan nemt kombineres med zebrafiske linjer, der harkedeligt genetiske mutationer, eller dem, hvor transgene tilgange til manipulation af præcise neurale kredsløb anvendes. Analysen kan også anvendes i andre fiske modeller. Sammen bør den beskrevne protokol lette vedtagelsen af denne enkle analyse til andre laboratorier.
Stress respons er ændret adfærdsmæssige og fysiologiske tilstande som følge af potentielt skadelige eller aversiv stimuli. Stress respons er bevaret i hele dyreriget, og er afgørende for overlevelsen af en organisme1. Årtiers forskning har i høj grad udvidet vores viden om nogle af de genetiske og neuronal mekanismer underliggende stress stater. I dag, områder af hjernen såsom amygdala og striatum2, og genetiske faktorer såsom kortikotropin releasing hormon (CRH), og glukokortikoid (gr) og mineralokortikoid receptorer ( Mr) er blevet undersøgtudførligt 3,4,5,6. På trods af disse kritiske fund, er meget stadig ukendt om genetiske og neuronal regulering af stress. Som sådan, mange stress relaterede lidelser lider af en mangel på terapeutika.
Genetisk ændrbare modelorganismer giver et nyttigt redskab i studiet af genetiske og neuronal kontrol af adfærd. Især fiske modeller er ekstremt kraftige: de er små organismer med korte genererings tider, deres anvendelse i laboratorieomgivelser er facile, deres genomer er nemme at ændre, og som hvirveldyr deler de ikke kun genetiske, men også Neuro anatomiske Homologi med deres pattedyr modparter7,8. Standard analyser til måling af stress kan kombineres med: zebrafisk linjer, der husly genetiske mutationer, eller dem, hvor manipulation af præcise neuronal delmængder er muligt, og virkningerne af enkelt gener eller definerede neuroner kan vurderes hurtigt og effektivt.
Behavioral, stress respons kan karakteriseres i fisk som perioder med Hyper-aktivitet eller længere perioder med inaktivitet (beslægtet med ‘ frysning ‘)9, reduceret udforskning10, hurtig vejrtrækning, reduceret fødeindtagelse11, og en sted-præference for bunden af en tank12. For eksempel, når de placeres i en ukendt tank, voksne: zebrafisk og andre små fisk modeller viser en indledende præference for den nederste halvdel af tanken, men med tiden, fiskene begynder at udforske top og bund halvdele med nær-lige frekvens12. Behandling af voksne med lægemidler kendt for at reducere angst forårsage fisk til at udforske umiddelbart den øverste halvdel10,13. Omvendt, lægemidler, der øger angst forårsage fisk til at vise stærk præference for den nederste halvdel af tanken12,14,15. Således, reduceret udforskning og præference for den nederste halvdel af tanken er enkle og pålidelige indikatorer for stress.
Som de fleste hvirveldyr drives stress respons i fisk af aktivering af hypothalamus-hypofyse-Inter-renal akse (HPI; analogt med hypothalamus-hypofyse-binyre [hPa]-aksen i pattedyr)14,16. Hypothalamus neuroner udtrykker hormonet kortikotropin-releasing hormon (CRH) signal til hypofysen, som igen frigiver adrenocorticotropt releasing hormon (ACTH). ACTH derefter signaler til den inter-renal kirtel til at producere og udskille cortisol, som har en række downstream mål16, en af dem er negativ feedback på den CRH-producerende hypothalamus neuroner3,17, 18,19.
Her beskriver vi en metode til at vurdere adfærdsmæssige målinger af medfødte stress. For den opførsel, vi detalje protokoller ved hjælp af roman tank dykning test12,14. Vi derefter demonstrere, som et eksempel, at en kendt angstdæmpende stof, buspiron, reducerer adfærdsmæssige målinger af stress.
Zebrafish udviser en robust stress respons i en ny tank
Her beskriver vi en simpel adfærdsmæssig tilgang til at undersøge stress responser i voksne zebrafisk, og validere tilgangen som en simpel måling af stress ved hjælp af farmakologi.
Den nye tank test er en meget anvendt test for at undersøge medfødte stress i: zebrafisk og andre arter af fisk12,14,21,<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Jupiter Life Science Initiative på Florida Atlantic University til ERD og ACK. Dette arbejde blev også støttet af tilskud R21NS105071 (tildelt ACK og ERD) og R15MH118625 (tildelt ERD) fra National Institutes of Health.
Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
Infrared filter | Edmund Optics | ||
Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
Infrared LED lights | |||
Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
250mL beaker | |||
Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |