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方法文章

癫痫患者中同步进行的眼动追踪与单神经元记录

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DOI：

10.3791/59117

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2019年6月17日

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1Department of Chemical and Biomedical Engineering, and Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University, 2Departments of Neurosurgery and Neurology, Cedars-Sinai Medical Center, 3Center for Neural Science and Medicine, Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

本文内容

摘要

我们介绍了一种在人类中进行单神经元记录的同时结合眼动追踪的方法。我们展示了该方法的有效性，并说明了如何利用这一方法获取编码视觉搜索目标的人类内侧颞叶神经元。

摘要

对难治性癫痫患者进行颅内记录，为研究人类个体神经元在主动行为过程中的活动提供了独特的机会。量化行为的重要工具之一是眼动追踪，这是研究视觉注意不可或缺的手段。然而，眼动追踪与侵入性电生理记录同时使用具有挑战性，因此该方法迄今应用较少。本文介绍了一种经过验证的实验方案，可在人类受试者中同步开展单神经元记录与眼动追踪。我们详细描述了系统的连接方式以及记录神经元活动和眼动的最优参数设置。为说明该方法的应用价值，我们总结了通过此实验装置所获得的研究成果。这些数据表明，在基于记忆的视觉搜索任务中使用眼动追踪，使我们能够识别出一类新的神经元——目标神经元，其反应反映了对当前搜索目标的自上而下的注意。最后，我们讨论了该实验设置的意义以及可能遇到问题的解决方案。综上所述，我们的实验方案和研究结果表明，在人类中同步进行单神经元记录与眼动追踪是研究人脑功能的有效方法，它填补了动物神经生理学与人类认知神经科学之间长期缺失的关键环节。

引言

人类单神经元记录是一种独特而强大的工具，能够以极高的空间和时间分辨率探索人脑功能1。近年来，由于单神经元记录允许直接研究与人类认知密切相关的核心认知过程，该技术在认知神经科学领域得到了广泛应用。这种记录得以实现，源于临床上需要确定癫痫灶的位置，因此会对疑似局灶性癫痫的患者暂时植入深部电极。在此条件下，可通过混合型深部电极尖端伸出的微丝获取单神经元记录信号（有关植入混合型深部电极的手术方法的详细描述见先前的实验方案2）。该方法已被用于研究人类记忆3,4、情绪5,6以及注意7,8等多个方面。

眼动追踪技术用于测量认知任务过程中的注视位置和眼球运动（包括注视和扫视）。基于视频的眼动仪通常利用角膜反射点和瞳孔中心作为随时间追踪的特征点9。眼动追踪是研究视觉注意的重要方法，因为在大多数自然行为中，注视位置能够反映注意力的集中区域10,11,12。该技术已被广泛应用于健康个体13以及神经疾病人群14,15,16的视觉注意研究。

尽管单神经元记录和眼动追踪在人类研究中均已得到广泛应用，但很少有研究将这两种技术同时使用。因此，人类大脑中的神经元如何响应眼动，以及它们是否对当前注视的刺激敏感，这些问题在很大程度上仍不清楚。这与猕猴研究形成对比，在猕猴研究中，结合眼动追踪与同步单神经元记录已成为一种标准工具。为了直接探究神经元对眼动的响应，我们将人类单神经元记录与眼动追踪相结合。本文描述了开展此类实验的详细方案，并通过一个具体实例展示其结果。

尽管人类内侧颞叶（MTL）在物体表征17,18和记忆功能3,19中的作用已得到充分证实，但目前尚不清楚MTL神经元是否受到自上而下注意力指向行为相关目标时的调节。研究此类神经元对于理解目标相关信息如何影响自下而上的视觉加工过程具有重要意义。本文展示了在记录神经元活动的同时结合眼动追踪技术，利用引导性视觉搜索这一经典范式来研究目标导向行为20,21,22,23,24,25的应用价值。通过该方法，我们近期描述了一类称为“目标神经元”的神经细胞，这类神经元可编码当前被注意的刺激是否为正在进行的搜索任务的目标8。下文将介绍重现该先前科学研究所需的实验方案。需注意的是，本示例中的方案可轻松调整以适用于任意视觉注意任务的研究。

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方案

1. 参与者

  1. 招募正在接受颅内电极植入以定位癫痫发作区域的难治性癫痫神经外科患者。
  2. 在所有临床指征明确的目标脑区植入带有嵌入式微丝电极的深部电极，通常包括杏仁核、海马、前扣带皮层和前辅助运动区的部分区域。有关植入细节，请参见我们先前的实验方案2。
  3. 患者返回癫痫监测病房后，连接用于宏观和微观记录的记录设备。包括仔细准备包含头部放大器的头套包裹装置（详见我们之前的描述2）。随后等待患者术后恢复，并在其完全清醒时进行测试（通常为术后至少36至48小时）。

2. 实验装置

  1. 根据图1中的示意图，将刺激计算机连接到电生理系统和眼动仪。
  2. 使用远程非侵入性红外眼动追踪系统（见材料表）。将眼动追踪系统放置在一个稳固的移动推车上（图1A、B）。在同一推车上安装一个可调节的机械臂，用于固定液晶显示器（LCD）。使用远程模式追踪患者头部和眼睛的运动。
  3. 在眼动追踪推车上放置一台充满电的不间断电源（UPS），并将所有与眼动追踪相关的设备（即患者前方的LCD显示器、眼动仪摄像头和光源、眼动仪主机计算机）连接至该UPS，而非外部电源。
  4. 调整患者与LCD屏幕之间的距离至60–70 cm，并调节LCD屏幕的角度，使其表面大致与患者面部平行。根据患者头部的高度调节屏幕位置，使眼动仪摄像头大致与患者鼻部处于同一高度。
  5. 为患者提供按钮盒或键盘。在开始实验前，确认触发信号（TTL）和按钮按压能够被正确记录。

3. 单神经元记录

  1. 启动采集软件。首先目视检查宽带局部场电位（0.1 Hz - 8 kHz），确保其未受工频噪声污染。若存在噪声，请遵循标准流程去除噪声（参见讨论部分）。
  2. 为识别单个神经元，对信号进行带通滤波（300 Hz - 8 kHz）。为每束八通道微丝电极选择其中一根作为参考电极。尝试不同的参考电极并进行调整，以确保：（1）其余7个通道显示清晰的神经元信号；（2）参考电极本身不包含神经元活动。将输入范围设置为 ± 2,000 µV。
  3. 在开始记录数据前，启用将数据保存为NRD文件的功能（即用于后续离线 spike sorting 的宽带原始数据文件）。将采样率设置为 32 kHz。

4. 眼动追踪

  1. 启动眼动追踪软件。由于该系统无需头部固定，请将贴纸贴在患者的前额上，以便眼动仪能够校正头部运动。
  2. 调整眼动仪与患者之间的距离和角度，使目标标记、头部距离、瞳孔和角膜反射（CR）在眼动追踪软件中均显示为就绪状态（以绿色显示；图2 展示了一个良好的摄像头设置界面示例）。点击要记录的眼睛，并将采样率设置为 500 Hz。
  3. 使用自动调节功能来设置瞳孔和角膜反射（CR）的阈值。对于佩戴眼镜的患者，需调整照明器和摄像头的位置和/或角度，以避免镜片反光干扰瞳孔信号的获取。
  4. 在每个实验区块开始时，使用内置的9点网格法对眼动仪进行校准。确认眼位（以“+”表示）能准确形成一个9点网格分布，否则需重新校准。
  5. 接受校准结果并进行验证。若最大验证误差 < 2° 且平均验证误差 < 1°，则接受验证结果；否则需重新进行验证。
  6. 执行漂移校正，然后进入正式实验阶段。

5. 任务

  1. 在此视觉搜索任务中，使用我们先前研究中的刺激材料14，并按照之前描述的任务流程进行8。
  2. 向参与者提供任务说明。指导参与者在搜索阵列中寻找目标项目，并尽快做出反应。如果发现目标，则按反应盒（见材料表）的左侧按钮；如果认为目标不存在，则按右侧按钮。明确告知参与者，实验中将包含目标出现和目标未出现的试次。
  3. 启动刺激呈现软件（见材料表）并运行任务：首先呈现1秒的目标线索，然后使用刺激呈现软件呈现搜索阵列。记录按键反应，并为参与者提供逐次试次的反馈（正确、错误或超时）。

6. 数据分析

  1. 由于数据采集系统与眼动追踪系统使用不同的时钟，需利用行为日志文件查找电生理记录与眼动追踪之间的对齐时间戳。在进行后续分析之前，应先匹配电生理记录与眼动追踪的触发信号。根据时间戳和分析时间窗，分别提取电生理记录和眼动追踪的数据片段。
  2. 使用半自动模板匹配算法 Osort26，并按照先前描述的步骤2,26识别可能的单个神经元。在进入后续分析前，需评估分类结果的质量2。
  3. 分析眼动数据时，首先将眼动仪输出的 EDF 数据转换为 ASCII 格式，并提取注视点和扫视事件。然后导入 ASCII 文件，并将以下信息保存为 MAT 文件：(1) 时间戳，(2) 眼动坐标 (x,y)，(3) 瞳孔大小，以及 (4) 事件时间戳。将连续记录按每个试验进行分割。
  4. 按照先前描述的方法分析神经放电与行为之间的相关性8。

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结果

为了说明上述方法的使用，我们接下来简要描述一个我们近期发表的使用案例8。在患者执行视觉搜索任务时，我们记录了来自人类内侧颞叶（MTL；杏仁核和海马）的228个单个神经元活动（图3A，B）。在此任务期间，我们研究了神经元活动是否能够区分对目标和干扰物的注视。

首先，当我们以按键时刻对齐神经反应时，发现了一些在目标出现试验与目标缺失试验之间表现出差异性活动的神经元（图 3C，D）。重要的是，在同步进行眼动追踪的基础上，开展了基于注视的分析。为筛选此类目标神经元，采用了从注视开始前 200 ms 至注视结束（下一次眼跳开始）后 200 ms 时间窗口内的平均放电率。内侧颞叶（MTL）神经元中有一部分（50/228；21.9%...

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讨论

在本实验方案中，我们介绍了如何结合单神经元记录与同步眼动追踪，并阐述了如何利用该方法在人类内侧颞叶（MTL）中识别目标神经元。

该实验设置包含三台计算机：一台用于执行任务（刺激计算机），一台用于运行眼动仪，另一台用于运行采集系统。为了实现三个系统之间的同步，通过并行端口将刺激计算机的 TTL 触发信号发送至电生理系统（图 1C）。同时，刺激计算机通过以太网线将相同的 TTL 信号发送至眼动仪。在本示例中，刺激计算机的扩展坞应具备并行端口（图 1D），或者可选地，配备 PCI Express 并行端口卡或类似设备。

用于放置刺激计算机和眼动仪的移动推车配备了可调节臂，可灵活地将屏幕定位在患者面前（图1A，B）。建议使用不间断电源（UPS）为推车上的设备供电，以消除由于眼动仪靠近患者头部而引入电生理记录中的线路噪声（

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢所有患者的参与。本研究得到了洛克菲勒神经科学研究所、自闭症科学基金会和dana基金会（资助对象：S.W.）、美国国家科学基金会CAREER奖（1554105，资助对象：U.R.）以及美国国立卫生研究院（R01MH110831和U01NS098961，资助对象：U.R.）的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。 我们感谢James Lee、Erika Quan以及Cedars-Sinai模拟中心的工作人员在制作演示视频过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cedrus 反应盒 Cedrus (https://cedrus.com/) RB-844 按钮盒
Dell 笔记本电脑 Dell (https://dell.com) Precision 7520 刺激呈现计算机
EyeLink 眼动仪 SR Research (https://www.sr-research.com) 1000 Plus 远程型，配备笔记本主机和 LCD 臂式支架 眼动追踪
MATLAB MathWorks Inc R2016a (RRID: SCR_001622) 数据分析
Neuralynx 神经生理学系统 Neuralynx (https://neuralynx.com) ATLAS 128 电生理学
Osort 开源 v4.1 (RRID: SCR_015869) 峰电位分类算法
心理物理学工具箱 开源 PTB3 ( RRID: SCR_002881) 用于实现心理物理学实验的 Matlab 工具箱

参考文献

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