Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת ICR מוסמך (המכון לחקר הסרטן) מודל murine של זיהום מערכת העצבים המרכזית כדי להציג את ההתפתחות של נוירופתיה. ניטור ויראלי חריפה הפרעות נצאליטיות על ידי עשרות מחלה זהה יכול להתבצע על מראה דנגי וירוס המושרה נוירופתיה ב vivo.
Abstract
וירוס דנגה (DENV), וירוס המועבר על-ידי היתושים המועברים על ידי יתוש, עלול לגרום למחלה חמורה הידועה בשם קדחת דנגה מדמם, אשר מאופיין על ידי סיבוכים קטלניים עקב דליפת פלזמה, מיימת, היתוך, מצוקה נשימתית, . דימום חמור וליקוי איברים כמה מקרים של זיהום DENV להציג ביטויים נוירולוגיים; עם זאת, מחקרים לא חקרו באופן נוירופתוגנזה המושרה של DENV יותר. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול להשתמש חיסוני מוסמך ICR (המכון לחקר הסרטן) העכבר לחקירת אינדוקציה של מערכת העצבים המרכזית (CN) זיהום עם DENV, ואחריו את ההתקדמות של דלקת קרום המוח נגיפי חריפה כמו מחלה.
Introduction
DENV, וירוס המועברות על ידי משפחת פליורידיי , מכיל גנום ה-RNA הגיוני מקודד שלושה חלבונים מבניים נגיפי (capsid, טרום קרום, מעטפה) ו שבעה חלבונים לא מבניים ויראלי (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , ו-NS5). ארבעת סוגי הסרווים של DENV (DENV1-4), אשר להדביק כ 390,000,000 אנשים מדי שנה, לגרום נטל גלובלי אף על פי ממשלות ביים מאמצים משמעותיים לקראת וקטור יתושים ושליטה מחלות1. כיום, חיסונים להגנה ותרופות אנטי-ויראליות טיפוליות בשלבי פיתוח ודורשות אימות לטווח ארוך יותר2. בתחום הקליני, למרות חולה דנגה עם זיהום של ה-CN הוא נדיר, זה צריך להיות בחקר נוסף כדי להבין את הגיוון של פיתוח מחלת דנגה3. יש צורך בחקירה ובאימות נוספים; בעיקר, ארגון הבריאות העולמי (אשר) כלל את המעורבות של ליקוי המוח, כגון ליקוי קוגניטיבי, עוויתות, אנצפלופתיה, ודלקת קרום המוח, בסיווג חמור דנגה3,4. בניית מודלים בעלי חיים של זיהום DENV היא הכרחית לחקר נוירופתוגנזה של זיהום DENV.
ליצירת זיהום ה-CN של DENV, מספר מחקרים ביצעו מסלולים שונים של זיהום DENV, כולל (1) גרם חיסונים של C57BL/6 עכברים שקיבלו 4 x 103 פלאק-להרכיב יחידות (pfu) של DENV3 המותאם ל5, 6, (2) הצפק פנימי של עכברים balb/c שקיבלו 7 x 104 pfu של מבחנה נוירומותאמת DENV47, (3) גרם החיסון של עכברים שוויצריים שקיבלו 1 x 105 pfu של vivo neuroadapted DENV18, ו (4) גרם ו-הצפק משותפת של עכברי מוצצים ICR שהתקבלו 1 x 106 pfu של לא מותאם DENV29. על פי ממצאי מחקרים אלה5,6,7,8,9, הזיהום denv בעכברים התוצאה שכפול נגיפי במוח, המוביל נגיפי חריפה תסמונות של דלקת קרום המוח, שינויים התנהגותיים מלווים בשיתוק איברים וחוסר יציבות, מערכת העצבים העצבית והדלקת, דליפת פלזמה כללית ומקומית באמצעות מחסום הדם-מוחי (BBB) וללא השפעה. כל התוצאות ממחקרים אלה5,6,7,8,9 הראו את היכולת של denv להדביק את המוח ואת אינדוקציה של דלקת קרום המוח הנגיפי חריפה כמו מחלה לאחר הידבקות.
בהתבסס על הממצאים הנוכחיים שלנו9,10,11,12,13,14,15, יצרנו מודל murine של זיהום denv כמו ב vivo פלטפורמה כדי לבחון את היעילות הטיפולית של סוכני ממוקדות/גורמים נגד שכפול נגיפי, כמו גם רעילות נוירו. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מנוצל כדי ליצור העכבר icr מוסמך החוצה כדי ללמוד זיהום של הפונקציה וכלה לפקח על פיתוח נזקי עם הרבה הקצבאות שנגרמו על ידי denv. התוצאות מציגות את ההתקדמות המשמעותית של המחלה כמו דלקת קרום המוח בעכברים נגועים DENV באופן תלוי זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולים ניסיוניים של מחקר בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדת המשתמש של המרכז הרפואי הביטחון הלאומי (מספר IACUC: 16-261), על פי ההנחיות שנקבעו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן.
1. הליך זיהום
- להכין DENV2 לא מותאם (זן PL046) מניות9 (התקבל במקור מן המרכזים לבקרת מחלות בטייוואן, החל 2.5 x 107 אל 1 x 109 pfu/mL).
- לדלל את המניה וירוס 1 x 106 pfu עם רוזוול פארק הזיכרון מכון (RPMI) 1640 בינוני לנפח הכולל של 40 μl.
- מילוי מזרק אחד 0.3 mL מצויד עם מחט של 30 גרם עם 10 μL (2.5 x 105 pfu) של וירוס מדולל, ולמלא 0.3 עוד מזרק מדגם mL מצויד במחט 30 G עם 30 μl (7.5 x 105 pfu) של וירוס מדולל.
-
להחזיק את 7 יום בן היניקה העכבר ICR ולנהל את השלבים הבאים.
- עבור הזרקת גרם, להחזיק את העכבר בתנוחה נוטה על ידי לחיצה על מאורקל בין האצבע המדד והאגודל, ו תאיים להזריק 10 μL של וירוס מדולל לאזור למדא, הנקודה בהצטלבות של משונן ותפר למדוגת . שישה עשרה
- לאחר הזרקת גרם, להחזיק את העכבר במצב פרקדן באמצעות האצבע המדד והאגודל ו intraperitoneally להזריק 30 μl של וירוס מדולל בעדינות לתוך הabdomenl murine.
הערה: כדי להימנע מקניבליזם, 75% אלכוהול משמש ליצירת אובדן זמני של תחושת הריח של האם. בנוסף, הציע לכסות את הציפוי בצואה ובשתן של אימם.
- הניחו את עכברי היניקה בחזרה בכלובים שלהם והמתינו 5 דקות כדי לבדוק את בטיחות הגירוי שלהם עם האוויקות של עכברים, כולל הליכה וחלב אם יניקה.
הערה: לרוב, עכברים להפגין הגירוי הרגיל של פעילות הפוסט, אין נראה כל השפעות מזיקות בעקבות האתגר הטכני. במהלך ניסוי זה, החיות היו מתוחזקים על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדת המשתמש של המרכז הרפואי הביטחון הלאומי, טייוואן. - להעריך את ההתקדמות היומית של העכברים במונחים של משקל הגוף (באמצעות איזון יקרוגרם), מחלה נגיפית חריפה של דלקת קרום המוח (על ידי מחלה הבקיע כפי שמתואר בסעיף 2), ושיעור ההישרדות9,10,11 ,12,13,14,15.
2. ניקוד מחלות
- לעקוב אחר כיתה של דלקת קרום המוח הנגיפית חריפה כמו. הקצאת ניקוד של 0 לעכברים בריאים; 1 לעכברים עם תסמיני מחלה קלה, כולל ירידה במשקל, ניידות מופחתת וכיוון גוף הגיבן; 2 לעכברים המוצגים התקף ללימבי; 3 לעכברים את החולשה הלימבית התערוכה, כולל נע עם קושי האיבר הקדמי או חולשה האיבר האחורי; 4 לשיתוק; . חמש למוות
הערה: לאחר הניקוד מגיע 3, תסמיני המחלה נחשבים להתפתח במהירות. - להתוות את הניקוד של המחלה, על פי שלב 2.1, עבור כל יום כדמות עקומה מבוססת באמצעות ממוצע ± SD של תוצאות המבחן היומי בכל קבוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חמור קדחת דנגה הקשורים סיבוכים נוירולוגיים דווחו בחולים עבור פתוגנזה דנגה4. למרות המקרים האלה הם נדירים במרפאה, יצירת מודל מורלא מוסמך של זיהום DENV ניתן להשתמש לא רק לימוד immunopathogenesis אלא גם לחקירת זיהום של הפונקציה, נוירודלקת, נוירורעילות, ו ויראלי חריפה מחלה כמו דלקת קרום המוח. במחקר זה, על פי המודל הנוכחי שלנו9,10,11,12,13,14,15, שבעה עכברים מוצצים של icr בן יום חוסנו במקביל עם DENV2 באמצעות מיקרוהזרקה גרם (2.5 x 105 pfu) והזרקת הצפק (7.5 x 105 Pfu) (איור 1). בעקבות זיהום, ביצעו ניתוחים רבים כדי להראות נוכחות של שכפול dsrna, חלבון נגיפי ביטוי, ושחרור וירוס במוח הנגוע denv9,10,11,12 ,13,14,15. ניסויים אלה הראו כי מוצלח במודל vivo של זיהום DENV, שכפול, ושחרור הוקמה.
כדי להעריך את האינדוקציה של דלקת קרום המוח הנגיפי החריפה בדומה למחלות9,10,11,12,13,14,15, אנו מנטרים את השינויים במשקל הגוף בעכברים נגועים DENV. לעומת השינויים במשקל הגוף בקבוצה מבוים (שם העכברים חוסנו עם RPMI בינוני בלבד), איור 2 מראה עלייה בקבוצה מבוים אך משמעותי (P < 0.01) ירידה במשקל הגוף בעכברים נגועים. על פי הסימפטומים של דלקת קרום המוח, כמו לגיבן יציבה, התפיסה הלימבית, חולשה ללימבית, שיתוק, ומוות, כפי שנראה בעכברים הנגועים denv, איור 3 מראה משמעותי (P < 0.05) להגדיל ב הציון הקליני בעכברים שנדבקו DENV. שיטת ההישרדות באיור 4 מראה צמצום תלוי זמן בקצב ההישרדות (P < 0.001) של העכברים הנגועים denv. הנתונים מצביעים על הקמת מודל זיהומיות של DENV ב-CN, אשר מראה את ההתקדמות של המחלה הנגיפית חריפה כמו דלקת קרום המוח.
איור 1: תכנון ניסיוני עבור וירוס דנגה (DENV) זיהום עכברים מוצצים. שבעה עכברים מוצצים ICR בן יום חוסנו עם DENV2 PL046 על ידי בו זריקות תוך גולגולתי ו הצפק. מדדנו שינויים במשקל הגוף, תוצאת המחלה ותמותה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: משקל הגוף בעכברים מוצצים במהלך נגיף דנגה (DENV) זיהום. ב-DENV2 הנגועים בעכבר היניקה ICR (n = 12), שינויים במשקל הגוף נמדדו ליום. בעקבות בדיקה חתומה של Wilcoxon, הערכים מוצגים כממוצע ± SD. * *p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאת המחלה הנצבתית בעכברים מוצצים בזמן וירוס דנגה (DENV) זיהום. בעקבות זיהום DENV2 ב-ICR עכברים מוצצים (n = 12), שינויים בזמן קינטי בעשרות הקליני עבור תנוחת הגיבן (ציון 1), התפיסה הלימבית (ציון 2), חולשה ללימבית (ציון 3), שיתוק (ציון 4), ומוות (ציון 5) נמדדו. בעקבות בדיקה חתומה של Wilcoxon, הערכים מוצגים כממוצע ± SD. *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שיעור ההישרדות של עכברים מוצצים במהלך נגיף דנגה (DENV) זיהום. זמן שינויים קינטית בשיעורי ההישרדות נמדדו ב-DENV2 הנגועים ICR היניקה עכברים (n = 12). לאחר בדיקה בדרגת יומן, הערכים מוצגים כממוצע ± SD. * * *p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזיהום denv זוהה ב-cn של מטופלים חמורים דנגה3,17, מציע את האפשרות של ביטוי של דלקת קרום המוח נגיפי חריפה התרחשה במהלך פתוגנזה דנגה. כאן, אנו מדווחים על מודל vivo murine של זיהום DENV לחקר מעורבות של התפקוד העצמי של ה-CN דנגה, במיוחד עם דגש על DENV המושרה דלקת קרום המוח ויראלי כמו מחלות. לעומת הדגמים הקודמים, במיוחד עבור זיהום אחד במסלול (לעירוי בלבד, תוך הצפק בלבד, או גרם בלבד), סיכוייו גבוה מאוד (1 x 108 pfu) של denv מנוצל עכברים המוסמכת. עם זאת, ב עכברים בסיכון חיסוני, נמוך יחסית אך variant (1 x 105 כדי 1 x 108 pfu) של denv ניתן לבצע18,19,20. במחקר זה, השתמשנו בזיהום שני מסלולים כדי לגרום במקביל לזיהום מערכתית עם סיכוייו נמוך (תוך גולגולתי: 2.5 x 10 5 pfu;תוך הצפק: 7.5 x 105 pfu) של denv היונקים האנטי חיסוני icr. ההתקדמות של המחלה כמו דלקת קרום המוח הוא לגמרי לחלוטין9,10,11,12,13,14,15 . המגבלה האפשרית של מחקר זה היא, לפיכך, לטפל באמצעות הזרקת תוך-גולגולתי במקביל הזרקה בתוך הצפק. למרות שהוא מלאכותי-עם זאת, מתאים לעבודות קודמות שלאחרים5,6,7,8 ו-9,10,11, 12,13,14,15-denv משוכפל באופן פעיל במוח מורלין הניסיוני9,10,11, מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , 15, ואת ההשפעות האפשריות של גורמים ויראלי התגובות המארחים על דלקת נוירו, כמו גם רעלים, הם, לכן, של עניין.
עבור נוירופתוגנזה, גירוי של ואפופטוזיס התא העצבי מופעלות על ידי זיהום denv, כמו גם דלקת המוח, כגון הפעלת תא microglial ואחריו מקדם נמק הגידול ציטוקינים-α (tnf-α) הייצור8, 12,15. הרעלה ישירה הנגרמת על ידי זיהום DENV ונוירוגרם עקיף יזום על ידי תגובות החיסונית מארח הם העריכו להיות מעורב דלקת המוח דנגה. דלקת קרום המוח הנגיפי נגרמת על ידי הנגיף הנגרמת על ידי הווירוס שנגרמה מהמוח של3,21. תסמינים קליניים נפוצים הם חום גבוה, כאב ראש, צוואר נוקשה, גב, הקאות, ובלבול, בעוד מקרים חמורים גם לפתח התקפים, שיתוק, ותרדמת21. על ידי ניטור השינויים בעשרות עם תנוחת הגיבן, התפיסה הלימבית, חולשה ללימבית, שיתוק, ומוות, התפתחות של מחלות אלה מראה את ההתקדמות של מחלה נגיפית חריפה של דלקת קרום המוח בעכברים הנגועים DENV9, מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , 15. בדרך כלל, אלה עכברים שנדבקו denv עם ציון של 3 (על פי שיטת הבקיע המחלה המוצגת בפרוטוקול) התקדמה במהירות לשיתוק ומוות. מנגנוני הפתוגניים הגורמים למחלות אלה דורשים חקירה נוספת; עם זאת, הוא העריך כי תפקוד עצבי ואחריו השראה נוירופתיה הוא מעורב21. מיקוד שכפול נגיפי, כמו גם tnf-α-בתיווך דלקת המוח10,11,12,13,14, לפחות בחלק, לדון השפעות טיפוליות נגד ההתקדמות של דנגה-הקשורים במחלה ויראלית חריפה כמו דלקת קרום המוח. הפרוטוקול של מחקר זה יכול לשמש ליצירת מודל פתולוגי כמו דלקת קרום המוח של הידבקות DENV.
מחקרים מסוימים תיארו את אינדוקציה של גרם דימום הנגרמת על ידי זיהום denv במוח22,23. בעבר הצגנו את האינדוקציה של BBB הפרעה ב-DENV נגועים עכברים9. למרות DENV אינו מזוהה כווירוס נוירוטרופי, DENV יכול לייצר זיהום יעיל בתאים עצביים ב vivo ו מבחנה8,11. דופמין D2 קולטן (D2R) הוא העריך להיות קולטן עצבי עבור זיהום DENV, ו פרמקונוספולוגית מיקוד D2R ביעילות מפחית את זיהום DENV בתאים עצביים ב vivo ו בחוץ מבחנה, כמו גם מחלה המושרה מחלות הנצלטיות11, . עשרים וארבע אסטרטגיות טיפוליות אפשריות נגד דלקת קרום המוח ויראלי חשוב לפתח כך במקרים חמורים דנגה עם סיבוכים נוירולוגיים ניתן לטפל. עבור היישום העתידי שלה, פרוטוקול זה של מודל מחלה באמצעות זיהום DENV במוח עשוי להיות בפלטפורמת vivo כדי למסך לא רק את הגורמים ויראלי ומארח הקשורים נוירופתוגנזה, אלא גם מאפשר אנטי ויראליות ואנטי נצלטיים תרופות. בנוגע לשכיחות של הפרעות נוירולוגיות משתנה הנגרמת על ידי זיהום DENV25 על ידי פרוטוקול זה הוקמה, ההבדל בין סוגי משתנה ו/או זנים של denv לגרימת תפקוד נוירולוגי הוא צורך באימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST107-2321-B-038-001) ואת מימון הפנים הפנימי 106TMU-CIT-01-2, טאיפיי, טייוואן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluting virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral and intraperitoneal injection |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weight mouse |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Infect mouse |
| Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Our murine model |
References
- Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055 (2016).
- Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
- Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
- Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
- Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
- de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
- Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
- Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
- Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
- Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
- Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
- Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715 (2018).
- Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91 (2017).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
- Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
- Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
- Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
- Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
- Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
- Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
- Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
- Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
- Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116 (2017).
