Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un iCR immunocompetente (Istituto di ricerca sul cancro) modello murino di infezione del sistema nervoso centrale per visualizzare lo sviluppo della neuropatia. Il monitoraggio dei disturbi encefalitici virali con punteggi di malattia identici potrebbe essere eseguito per mostrare la neuropatia indotta dal virus dengue in vivo.
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Articolo metodologico
Un modello Murine di encefalite virale acuta indotta da virus dengue
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il virus dengue (DENV), un virus trasmesso da artrodi trasmesso dalle zanzare, può causare la grave malattia nota come febbre emorragica dengue, caratterizzata da complicazioni letali dovute a perdite di plasma, asciti, effusioni pleuriche, grave emorragia e compromissione dell'organo. Alcuni casi di infezione Da DENV presentano manifestazioni neurologiche; tuttavia, gli studi non hanno esplorato ulteriormente la neuropatogene indotta da DENV. In questo studio, presentiamo un protocollo per utilizzare un topo ICR (Istituto di ricerca sul cancro) immunocompetente per studiare l'induzione dell'infezione del sistema nervoso centrale (SNC) con DENV, seguito dalla progressione di encefalite virale acuta malattia.
Introduzione
DENV, un virus artropode della famiglia Flaviviridae, contiene un genoma di RNA a senso positivo che codifica tre proteine strutturali virali (capside, premembrana e busta) e sette proteine non strutturali virali (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). I quattro sierotipi di DENV (DENV1-4), che infettano circa 390 milioni di persone ogni anno, causano un onere globale anche se i governi hanno diretto notevoli sforzi verso il controllo dei vettori e delle malattie delle zanzare1. Attualmente, i vaccini protettivi e i farmaci antivirali terapeutici sono in fase di sviluppo e richiedono un'ulteriore convalida a lungo termine2. Nella pratica clinica, anche se un paziente dengue con infezione da SNC è raro, deve essere ulteriormente esplorato per comprendere la diversità dello sviluppo della malattia dengue3. Sono necessarie ulteriori indagini e validazioni; in particolare, l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha incluso il coinvolgimento del compromissione del SNC, come il danno cognitivo, le convulsioni, l'encefalopatia e l'encefalite, nella classificazione della dengue grave3,4. La costruzione di modelli animali di infezione da DENV è indispensabile per esplorare la neuropatogenesi dell'infezione da DENV.
Per generare l'infezione da CNS da parte di DENV, diversi studi hanno eseguito diverse vie di infezione da DENV, tra cui (1) l'inoculazione intracerebrale di topi C57BL/6 che hanno ricevuto 4 x 103 unità di formazione di placche (PFU) di DENV35non adattati, 6, (2) inoculazione intraperitoneale di topi BALB/c che hanno ricevuto 7 x 104 PFU di DENV47in vitro , (3) inoculazione intracerebrale di topi svizzeri che hanno ricevuto 1 x 105 PFU di DENV18in vivo e (4) co-inoculazione intracerebrale e intraperitale dei topi da allattamento ICR che hanno ricevuto 1 x 106 PFU di DENV29 nonadattati . Secondo i risultati di questi studi5,6,7,8,9, infezione DENV nei topi provocare la replicazione virale nel cervello, portando a virale acuta sindromi simili all'encefalite, cambiamenti comportamentali accompagnati da paralisi degli arti e instabilità posturale, neurotossicità e infiammazione del SNC, perdite plasmatiche generali e localizzate attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) e letalità. Tutti i risultati di questi studi5,6,7,8,9hanno dimostrato la capacità di DENV di infettare il SNC e l'induzione di encefalite virale acuta malattia a seguito di infezione.
Sulla base dei nostri risultati attuali9,10,11,12,13,14,15, abbiamo creato un modello murino di infezione DENV come un in vivo per esaminare l'efficacia terapeutica di agenti/fattori mirati contro la replicazione virale, nonché la neurotossicità. Qui, riportiamo il protocollo utilizzato per creare un topo ICR immunocompetente per studiare l'infezione da CnS e per monitorare lo sviluppo di neuropatie con diverse gravità causate da DENV. I risultati mostrano la progressione significativa della malattia simile all'encefalite nei topi infetti da DENV in modo dipendente dal tempo.
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Protocollo
I protocolli sperimentali di studio sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la cura degli animali e l'utente del National Defense Medical Center (numero IACUC: 16-261), secondo le linee guida stabilite dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan.
1. Procedura di infezione
- Preparare le scorte non adattate dENV2 (strain PL046)9 (originariamente ottenute dai Centers for Disease Control di Taiwan, che vanno da 2,5 x 107 a 1 x 109 PFU/mL).
- Diluire lo stock di virus a 1 x 106 PFU con Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio per un volume totale di 40 .L.
- Riempire una siringa da 0,3 mL dotata di un ago da 30 G con 10 x 105 PFU di virus diluito, e riempire un'altra siringa da 0,3 mL dotata di un ago da 30 G con 30 (7,5 x 105 PFU) di virus diluito.
-
Tenere il topo da urlo ICR di 7 giorni e seguire i seguenti passaggi.
- Per l'iniezione intracerebrale, tenere il mouse in una posizione prona premendo l'auricolare tra l'indice e il pollice, e intracerebralmente iniettare 10 L di virus diluito nell'area lambda, il punto all'intersezione della sutura sagittale e lambdoid 16.
- Dopo l'iniezione intracerebrale, tenere il topo in posizione supina utilizzando l'indice e il pollice e iniettare intraperitonealmente 30 L di virus diluito delicatamente nell'addomel murino.
NOTA: Per evitare il cannibalismo, il 75% di alcol viene utilizzato per creare una perdita temporanea della sensazione olfattiva della madre. Inoltre, si suggerisce di coprire le cucciolate con le feci e l'urina della madre.
- Posare i topi da latte nelle loro gabbie e attendere 5 min per controllare la loro poststimolazione di sicurezza con l'avidità dei topi, tra cui camminare e latte materno succhiare.
NOT: Molto spesso, i topi dimostrano una normale poststimolazione dell'attività e non sembrano esserci effetti nocivi a seguito della sfida tecnica. Durante questo esperimento, gli animali sono stati mantenuti dal Institutional Animal Care e User Committee del National Defense Medical Center, Taiwan. - Valutare il progresso giornaliero dei topi in termini di peso corporeo (utilizzando un equilibrio in microgrammo), malattia virale acuta (con il punteggio della malattia come descritto nella sezione 2), e il tasso di sopravvivenza9,10,11 ,12,13,14,15.
2. Punteggio di malattia
- Monitorare il grado di encefalite virale acuta malattie simili. Assegnare un punteggio pari a 0 ai mouse sani; 1 ai topi con sintomi di malattia minore, tra cui perdita di peso, mobilità ridotta e un orientamento del corpo gobbo; 2 ai topi che presentano crisi limbiche; 3 ai topi la debolezza limbica del dado, compreso il movimento con difficoltà e la debolezza dell'arto anteriore o dell'arto posteriore; 4 per la paralisi; 5 per la morte.
NOT: Una volta che il punteggio raggiunge 3, i sintomi della malattia sono considerati in rapida evoluzione. - Tracciare il punteggio della malattia, secondo il punto 2.1, per ogni giorno come una cifra basata sulla curva utilizzando la media SD dei punteggi dei test giornalieri in ogni gruppo.
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Risultati
Gravi complicazioni neurologiche associate alla dengue sono state segnalate nei pazienti per la patogenesi dengue4. Anche se questi casi sono rari in clinica, la creazione di un modello murino immunocompetente di infezione Da DENV può essere utilizzato non solo per studiare l'immunopatogene, ma anche per esplorare l'infezione da SNC, la neuroinfiammazione, la neurotossicità e il virale acuto una malattia simile all'encefalite. In questo studio, secondo il nostro at...
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Discussione
L'infezione da DENV è stata rilevata nel SNC di pazienti con dengue grave3,17, suggerendo la possibilità della manifestazione di encefalite virale acuta avvenuta durante la patogenesi dengue. Qui, riportiamo un modello murino in vivo dell'infezione da DENV per studiare il coinvolgimento della disfunzione del SNC nella dengue grave, in particolare con un focus sulle malattie acute simili all'encefalite acuta indotta da DENV. Rispetto ai modelli precedenti, in part...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST107-2321-B-038-001) e dal finanziamento intramurale 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Virus diluente |
| 0,3 mL Siringa da insulina | BD Ultra-FineII | 328838 | Iniezione intracerebrale e intraperitoneale |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Peso del topo |
| DENV2 non adattato (ceppo PL046) | I Centri per il controllo delle malattie di | Taiwan-Infettare il topo | |
| da latte Institute of Cancer Research (ICR) | BioLASCO Taiwan Co., | Ltd-Il | nostro modello murino |
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