Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

Resumen

Aquí, presentamos una levadura mejorada Detección protocolo para identificar los factores de transcripción (TFs) que se pueden unir a una región de ADN humana de interés de uno híbrido. Este método utiliza una tubería de proyección de alto rendimiento que puede interrogar el atascamiento de > 1.000 TFs en un solo experimento.

Resumen

Identificar los conjuntos de factores de transcripción (TFs) que regulan cada gen humano es una tarea de enormes proporciones que requiere la integración de numerosos enfoques experimentales y computacionales. Un tal método es el ensayo levadura uno híbrido (Y1H), en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de levadura usando genes del reportero. Y1H ensayos implican dos componentes: un 'ADN-bait' (por ejemplo., promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un 'TF-presa,' que puede ser examinado para la activación del gen reportero. Más publicados protocolos para realizar Y1H pantallas se basan en transformar cepas de levadura DNA-cebo TF-presa bibliotecas o arreglos de discos. Aquí, describimos un gasoducto, llamado Y1H mejorada (eY1H) de ensayos, donde las interacciones TF-DNA son interrogadas por el apareamiento de las cepas de ADN-cebo con una colección vestida de TF-presa cepas utilizando una matriz de alta densidad plataforma robótica (HDA) que permite la proyección en un 1.536 formato de la Colonia. Esto permite un aumento dramático en el rendimiento (60 secuencias de ADN-cebo contra > 1.000 TFs tarda dos semanas por el investigador) y reproducibilidad. Ilustran los diferentes tipos de resultados esperados analizando secuencias del promotor humano contra una gran variedad de 1.086 TFs humanas, así como ejemplos de problemas que pueden surgir durante la pantallas y cómo solucionarlos problemas.

Introducción

Un problema central en el campo biomédico es determinar los mecanismos por el que se regula cada gene humano. La transcripción es el primer paso en el control de los niveles de expresión de genes, y es regulado por sistemas de factores de transcripción (TFs) que son únicos a cada gen. Dado que los seres humanos codifican para > 1.500 TFs^1,2, identificar el conjunto completo de TFs que controlan la expresión de cada gen sigue siendo un desafío abierto.

Dos tipos de métodos se pueden utilizar para mapear las interacciones TF-DNA: métodos TF-centrado y centrado en la DNA

Protocolo

1. preparaciones

1. Placas SC −U −H (platos de Petri de 150 mm)
   Nota: Estas placas se utilizarán para el cultivo de las cepas de levadura DNA-cebo.
   1. Disolver la mezcla de abandono, levadura nitrógeno base (YNB), hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 920 mL de agua y pH de 5.9 con 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de media; ver tabla 2 para la composición). Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.
   2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
   3. Autocla....

Resultados

Tres factores deben considerarse al analizar resultados de pruebas de eY1H: la actividad de reportero de fondo de la cepa de ADN-bait, la fuerza de la actividad de periodista correspondiente a las interacciones TF-DNA y el número de colonias positivas. La actividad del reportero de fondo (es decir, autoactivity) de la cepa de ADN-cebo se refiere al crecimiento y al color de las colonias de levaduras en la placa de la lectura, incluso en la ausencia de un TF-presa general. Lo ideal sería no autoactive cepas muestran un fo.......

Discusión

Robótica eY1H acoplamiento proyección lo descrito aquí enormemente aumenta el rendimiento para identificar el conjunto de TFs que se unen a una región de ADN de interés, en comparación con la anterior proyección de biblioteca o proyección vestida enfoques basados en transformación. Además, las interacciones de la TF-DNA detectadas por eY1H ensayos son altamente reproducibles como el 90% de las interacciones detectadas positivas para todas las cuatro colonias probados por TF, y 90% de las interacciones vuelva a probar en .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLC Sigma		A8056-100G	Inhibidor competitivo para productos del gen HIS3
Sulfato de adenina (hemisulfateo), dihidrato	US Biologicals	A0865	Necesario para el crecimiento adecuado
la levadura Agar Alta fuerza de gel - Grado bacteriológico	American International Chemical	AGHGUP	Medios nutritivos para el crecimiento de levaduras
Sulfato de amonio	US Biologicals	A1450	Fuente de nitrógeno en medios de levadura sintética
D+ Glucosa anhidra	US Biologicals	G3050	Necesario para el crecimiento
Drop-Out Mix menos His, Leu, Tryp y Uracil, rico en adenina sin base de nitrógeno	US Biologicals	D9540-02	Medios sintéticos completos necesarios para el borde de crecimiento de la levadura
Medidor de pH multiparamétrico	Hanna Instruments	HI2020-01	Para medir el pH de medios selectivos
Palillos de dientes planos 750 ct	Diamante		Para rayar levaduras en placas de Petri
Cuentas de vidrio	Walter Stern	100C	Para esparcir levadura al hacer césped
Glicerol ≥ 99%	Millipore Sigma	G9012-1L	Necesario para hacer caldos de levadura congelados
L-Histidina	US Biologicals	H5100	Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos
L-Leucina	US Biologicals	L2020-05	Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos
L-Triptófano		Sigma T-0254	Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos
N, N-dimetilformamida	Sigma	319937-1L	Para hacer la solución X-gal
Omnipense Elite	Wheaton	W375030-A	Para dispensar volúmenes precisos de medios en placas Singer
Peptona, Bacteriológica	American International Chemical	PEBAUP	Fuente de proteína necesaria para el crecimiento de la levadura
Placa de Petri, 150 mm x15 mm	VWR	10753-950	Para el cultivo de cebos de levadura para cribado
PlusPlates	Singer Instruments	PLU-003	Para hacer placas rectangulares de agar para usar con Singer Robot
Precision Incubadora refrigerada de DBO de baja temperatura	ThermoFisher Scientific	PR205745R	Para incubar placas de levadura a temperatura constante
RePads 1.536 cortos	Singer Instruments	REP-005	Para transferir la matriz TF-presa, aparear la levadura y transferir la levadura a las placas de selección y lectura de diploides
RePads 384 corto	Singer Instruments	REP-004	Para transferir el array TF-prey de 384 a 1.536 en formato de colonia
RePads 96 largo	Singer Instruments	REP-001	Para transferir el array TF-prey del caldo de glicerol a la placa de agar
RePads 96 short	Singer Instruments	REP-002	Para transferir la matriz TF-prey de 96 a 384 colonias en formato
Singer HDA Robot RoToR	Singer Instruments		Para transferir levadura de alto rendimiento
Hidróxido de sodio (pellets/ACS certificado)	Fisher	S318-1	Para ajustar el pH de medios selectivos
Fosfato de sodio dibásico heptahidratado	Santa Cruz Biotechnology	sc-203402C	Requerido para la actividad reportera de LacZ en X-gal
Fosfato de sodio monobásico monohidratado	Santa Cruz Biotechnology	sc-202342B	Requerido para la actividad del reportero LacZ en X-gal
Uracil	Sigma	U0750-100G	Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos
X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-Dgalactopiranósido)	Gold Biotechnology	X4281C100	β-galactosidasa se vuelve incolora X-gal azul para detectar la interacción proteína-ADN
Extracto de levadura US	Biologicals	Y2010	Medio nutritivo para el crecimiento y la propagación de la levadura
Base de nitrógeno de levadura (polvo) sin AA, carbohidratos y sin AS	US Biologicals	Y2030	Necesario para un crecimiento vigoroso de la levadura

de de la levadura de levadura