Wij presenteren een eenvoudige cytogenetische techniek met behulp van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om te bepalen van het tarief van de bevruchting en primaire sex-ratio van de haplodiploid invasieve plaag Bemisia tabaci.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een paar soorten sap-zuigende wittevlieg zijn enkele van de meest schadelijke terrestrische plagen wereldwijd vanwege de gewas-schade die ze toebrengen en plantenvirussen die ze vector. Ondanks talrijke studies van de biologie van deze soorten in verschillende omgevingen, een belangrijke levensgeschiedenis parameter, offspring sex ratio's, weinig aandacht heeft gekregen, maar is belangrijk voor het voorspellen van de populatiedynamiek. De primaire verhouding van de sex (sex ratio op oviposition) van Bemisia tabaci is nooit gemeld maar kan worden gevonden door de bepaling van het tarief van de bevruchting ei van dit insect van de haplodiploid. De techniek gaat de dechorionation van de eieren met bleekmiddel, een reeks fixatie stappen en de toepassing van de algemene DNA fluorescerende vlek, DAPI (4 ': 6-diamidino-2-phenylindole, een DNA-bindende fluorescente kleurstof), te binden aan mannelijke en vrouwelijke pronuclei. Hier presenteren we de techniek, en een voorbeeld van de toepassing ervan, om te testen of een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, beïnvloed de primaire sex-ratio van B. tabaci. Deze methode kan helpen bij bevolkingsonderzoeken van wittevlieg, of vast te stellen of geslacht toewijzing bestaat met bepaalde milieu prikkels.
Inleiding
De studie van geslacht verdeling, of de relatieve investering in mannelijke en vrouwelijke nakomelingen, is een hoeksteen van gedragsecologie1,2,3. Naast de macht voor het testen van adaptieve modellen van gedrag, kan te weten de seks toewijzing strategie van een organisme modellen voor de populatiedynamica verbeteren. In vele soorten, wordt seks toewijzing gecontroleerd door moeders. Ter vaststelling van geslacht toewijzing, is het belangrijk om te bepalen van de primaire sex-ratio of het aandeel van vrouwen op het moment van de ei-afzetting. Hoewel de sex ratio op volwassen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Zorg ervoor dat alle werkzaamheden wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur in een goed geventileerde ruimte of in een zuurkast. Alle 'druppels' in dit protocol worden gedefinieerd als 5 – 20 µL, afhankelijk van de voorkeur van de exploitant.
1. eerste Setup
- Toestaan dat vrouwelijke wittevlieg te oviposit op schone bladeren. Voorbeelden voor oviposition arenas zijn clip kooien of bladeren gesneden te passen op agar in een petrischaal. Maak een coverable gat in de kooi van de clip of de petrischaal cover invoegen en verwijderen van de volwassenen. Alternatief, zet snel een vaartuig van de verzamelde volwass....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te testen of Rickettsia is van invloed op het tarief van de bevruchting van B. tabaci MEAM1 vrouwtjes, die wij gefokt Rickettsia-besmet (R+) of niet-geïnfecteerde (R-) B. tabaci op cowpea planten (Vigna unguiculata) in aparte kooien op een 16 h licht/8 h donkere fotoperiode, 27 ° C en 70% relatieve vochtigheid. R+ werden R- vierde instar wittevlieg zorgvuldig verwijderd uit bladeren en geïsoleerd i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol is de eerste om de bevruchting tarief of primaire sex ratio van B. tabacite leggen. De uitdaging van dit protocol is dat er onderzoekers om te leren hoe te te behandelen de wittevlieg eieren snel, ervoor te zorgen dat niet meer dan 1 uur verstreken is sinds de eieren waren oviposited totdat ze zijn vastgesteld. Tijdens voorbereidende experimenten waren de eieren die waren vastgesteld op 3 uur of meer postoviposition te oud om te observeren van bevruchting, als syngamy had plaatsgevonden en mitotisch.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie van NSF (DEB-1020460) te M.S.H. en een USDA AFRI-grant (2010-03752) te M.S.H. De auteurs bedanken Brennan Zehr kleuring wittevlieg eieren met veel vaardigheid en Zen. De auteurs bedanken Mike Riehle voor het toestaan van het gebruik van zijn fluorescente microscoop voor imaging. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Marco Gebiola voor de beelden van het ei. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Jimmy Conway voor het helpen op beslissende momenten tijdens de experimenten.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Any | ||
| 1x TBST | Any | 5x oplossing gemaakt van 30 g Tris, 43,8 g NaCl, 5 ml Tween-20 en 1,0 g NaN3 pH 7,5, en gebracht naar 1 L met PCR-kwaliteit water | |
| Bleach | Clorox | Elke huishoudelijke bleekmiddel werkt zolang het verdund kan worden tot 0,83% natriumhypochloriet | |
| Klare nagellak | Any | ||
| DAPI dilactaat | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Verdun tot 70% EtOH | |
| Fluorescente microscoop | Nikon | Nikon Eclipse 50i werd gebruikt in dit experiment, maar elke fluorescente microscoop met 340/380 nm excitatiefilter en minimaal 4-10x vergroting kan worden gebruikt | |
| Glacial azijnzuur | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscoop | Wild | Een Wild M5A-microscoop werd gebruikt voor dit experiment, maar elke microscoop waarbij de operator de witte vlieg-eieren duidelijk kan zien, kan worden gebruikt | |
| Microscoopglazen | Any | De methoden zijn voor glazen van 18 mm x 18 mm. Er moet meer montagemiddel worden toegevoegd voor grotere glazen. | |
| Microscoopglazen | Any | ||
| Minuten naald pins | BioQuip | 1208SA | Minuten naald pins zijn optioneel voor het vervaardigen van sondes met pipettentips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propylgallaat | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipetten | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand wegwerpbare borosilicaatglas Pasteur pipetten 5,75 inch. Een Bunsen-brander kan ook nodig zijn als de operator de pipetten wil verlengen en versmallen |
| PCR-kwaliteit water | Any | ||
| Pipettips | Any | Pipettips zijn optioneel voor het vervaardigen van sondes met minuten naald pins | |
| Kleine druppelfles | Any | Moet passen op Pasteur pipet | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
Referenties
- Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
