ミトコンドリアの呼吸は生物の生存にとって重要ですしたがって、酸素消費量は、ミトコンドリアの健康の優れた指標です。このプロトコルでは基底を測定する市販の呼吸の使用を述べるし、最大酸素消費量のライブ、線虫そのまま・自由に運動。
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この記事について
サマリー
要約
最適なミトコンドリアの機能は、これら神経系および筋のような高いエネルギー需要を持つセルを中心に、健康な細胞の活動にとって重要です。一貫性のある、このミトコンドリア機能障害は無数の神経変性疾患と一般的に高齢化に関連付けられています。線虫は、ミトコンドリア機能の多くの複雑さを解明するための強力なモデル システムをされています。ミトコンドリアの呼吸はミトコンドリア機能の強力な指標と最近開発された respirometers は、細胞内呼吸を測定する最新のプラットフォームを提供します。このプロトコルでは、ライブ、そのままc. の elegansの解析手法を提供します。このプロトコルは 〜 7 日間の期間にわたる、(1) 成長と注入する化合物の線虫、 (2) の合成とプローブ、(3) 薬剤の読み込みとカートリッジの平衡、ワームの分析の準備 (4) 水和の同期するための手順が含まれていますプレートと分析を実行すると、(5) の後の実験データ解析。
概要
アデノシン三リン酸塩 (ATP)、細胞のエネルギーの主要なソースは、ミトコンドリアの電子輸送鎖 (ETC) 内のミトコンドリアの膜にある酵素によって生成されます。ピルビン酸は、ミトコンドリアの ATP の生産に利用されている主要代謝物は、ベタニン脱炭酸アセチル補酵素 A (CoA) を生成する、ミトコンドリア マトリックスにインポートされます。その後、アセチル CoA はクエン酸ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) キー電子キャリア分子の生成に終ってを入力します。NADH から電子が酸素に ETC 経由で渡されるとき、プロトンは膜間で電気化学的勾配の世代で結果ミトコンドリアの膜間スペースに蓄積します。これらのプロトンは、ATP 合成酵素、ATP1 (図 1) の合成とその回転を運転のプロトン通過孔を介してミトコンドリア マトリックスに戻って、この電気化学的勾配にわたって膜間腔からフローさせます。
ミトコンドリアの機能はエネルギー生産に限定されていませんがカルシウムの恒常性、活性酸素種 (ROS) 清掃、アポトーシス、個体の健康2に批判的に位置決めの機能に重要なも。ミトコンドリアの機能は、様々 なアッセイ、ミトコンドリアの膜電位を測定解析、ATP と ROS レベル、およびミトコンドリアのカルシウム濃度に限ら....
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プロトコル
注:図 2は、完全なプロトコルの図式的な概観を提供します。
1. 成長と線虫密度9,10の同期
- 必要な遺伝的背景の L4 幼虫を転送 (例えば、N2 [野生] および sel 12 動物) 線虫成長メディア (NGM) 板 (レシピの表 1を参照) を新鮮な芝生の大腸菌(OP50)11のシードに。各緊張に少なくとも 2 つの 100 mm または 3 つの 60 mm プレートを使用します。3-4 日のため、またはプレートに卵や妊娠ワームの数が多いと集中しているまでは、適切な成長温度 (15-25 ° C) の間にワームを孵化させなさい。
- 卵と約 6 mL の M9 のバッファーを使用して皿のワームを洗う (レシピの表 1を参照) 線虫、伝達の 100 mm プレートあたりには各緊張に個々 の 15 mL 遠沈管にパスツール ピペットをガラスします。X g と動物の卵のペレットだけを保持、M9 バッファーを吸引 6,180 3 分のこれらの管をスピンダウンします。
- 漂白剤溶液の 3-4 mL を追加 (レシピの....
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結果
プロトコルを使用して記載、OCR の野生型動物と 3 つの異なるsel 12変異株と判断されました。sel 12プレセニリン17 c. の elegansオーソログをエンコードします。人間プレセニリン変異が家族性アルツハイマー病18の開発に関連付けられている最も一般的な遺伝的異常です。私たちの研究は野生型動物3と比較して変異動物で、 sel 12のミトコンドリア カルシウム濃度を示しています。Sel 12変異体と野生型の動物で OCR をsel 12突然変異の影響を調べるため測定したのでカルシウムの調節不全は、変更されたミトコンドリア機能3,19、20.......
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ディスカッション
ミトコンドリアの呼吸はミトコンドリア機能; の洞察力に富んだインジケーターです。したがって、体外か体内かどうか生物学的システムの酸素消費量を測定することは非常に貴重です。Respirometers 酸素または酸素分圧に比例した流れ電気の世代に依存する電流検出型酸素センサーを介して取得急冷したポルフィリンの蛍光体を使用して酸素レベルを感じる。クラーク電極は後者のカテゴリに分類、特に線虫の呼吸を分析しながら、文学で広範囲に使用されています。しかし、大規模なサンプル サイズと一度に 1 つ以上のサンプルを評価することができないことの必要性は非効率的にアンペロ メトリックの酸素センサーをなります。
このプロトコルは、ミトコンドリア、ミトコンドリア膜電位に影響を与える可能性があるプロセスになり、OCR を孤立させることがなくライブ、そのままc. の elegansの OCR を測定する簡単なガイドを提供します。考えると動物は、様々 なライフ ステージによって異なる OCR を展示、このプロトコルで使用される動物は時代の同期をする必要があります。若い動物があ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は、ラボでタツノオトシゴ XFp の確立に彼の指導の博士ケビン Bittman を認めたいと思います。健康の国民の協会は、GM088213 はこの仕事を支えたを付与します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100 mm、60 mm ペトリ皿 | Kord-Valmark Labware 製品 | 2900、2901 | |
| 1.5 mL 遠心分離管 | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL 円錐管 | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm カバーガラス | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL 円錐管 | Corning | 430829 | |
| 寒天 | フィッシャーサイエンティフィック | BP1423-2 | |
| バクトペプトン | BD、バクト | 211677 | |
| バクトトリプトン | BD、バクト | 211705 | |
| バクト酵母抽出 | 物BD、バクト | 212705 | |
| 漂白剤 | ジェネリック | ||
| 塩化カルシウム二水和物(CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| コレステロール | Fisher Scientific | C314-500 | |
| 脱イオン水 (dH2O) | |||
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| ガラスパスツールピペット | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| 硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4·7H2O) | フィッシャーサイエンティフィック | BP213-1 | |
| 二塩基性カリウム(K2HPO4) | フィッシャーサイエンティフィック | BP363-1 | |
| 一塩基性カリウム(KH2PO4) | フィッシャーサイエンティフィック | P285-500 | |
| 塩化ナトリウム | ッシャーサイエンティフィ | BP358-10 | |
| 水酸化ナトリウム(NaOH) | フィッシャーサイエンティフィック | BP359-500 | |
| リン酸二塩基性無水ナトリウム(Na2HPO4) | フィッシャーサイエンティフィック | BP332-1 | |
| タツノオトシゴXFpアナライザー | アジレント | ||
| ツノオトシゴXFpフラックスパック | アジレント | 103022-100 | |
| ジ化ナトリウム | シグマアルドリッチ | S2002 |
参考文献
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al.
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