Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה יוצר שיטה של השומנים droplet בידוד והיטהרות מן העכבר כבדים, באמצעות ערכת בידוד ומבוססת רשתית תוך-פלזמית.

Abstract

השומנים טיפות (LDs) הם ביו organelles נמצא בתוך ציטוזול את האיקריוטיים, כמה תאים prokaryotic. LDs מורכבים ליפידים ניטרלי עטוף ידי טפט של פוספוליפידים וחלבונים. שומנים LD הכבד, כגון סרמידים חלבונים הם מעורבים כמה מחלות הגורמות steatosis כבדית. למרות שיטות קודמות הוקמו לבידוד LD, הן דורשות זמן הכנה של ריאגנטים, שלא תוכננו עבור בידודו של תאים subcellular מרובים. אנחנו ביקשו להקים פרוטוקול חדש כדי לאפשר את ניתוקה של LDs רשתית תוך-פלזמית (ER), lysosomes של כבד עכבר אחת.

זה עוד רחוק, ריאגנטים כל שימוש בפרוטוקול המובאים כאן הם זמינים מסחרית ודורשים הכנה ריאגנט מינימלי מבלי להתפשר על טוהר LD. כאן אנו מציגים נתונים השוואת פרוטוקול חדש זה לפרוטוקול הדרגתיות סוכרוז סטנדרטי, הוכחת טוהר דומות, מורפולוגיה, ועם תשואה. בנוסף, נוכל לבודד ER ו- lysosomes שימוש באותה דגימת זרע, מתן נתונים היסטוריים תובנה היווצרות, שטף תאיים של שומנים וחלבונים הקשורים שלהם.

Introduction

LDs הם ביו organelles נמצא את ציטוזול של התאים האיקריוטיים, כמה תאים prokaryotic1,2,3. ליבת LD מורכב ליפידים נייטרלי כמו האסטרים כולסטרול טריגליצרידים (TG). הם גם מכילים סרמידים, מעורב הסלולר איתות המסלולים4,5ביואקטיביות שומנים. LDs מוקף של טפט פוספוליפיד, מצופה עם חלבונים, כולל את perilipin חלבונים perilipin 2 (PLIN2) ו- 3 (PLIN3)1,5,6. גם בהווה הם אנזימים lipogenic, lipases וקרום חלבונים סחר אשר קושרו מספר מחלות הכבד steatotic, כולל מחלת כבד שומני, מחלת כבד אלכוהולית של הפטיטיס C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs נחשבים טופס של הממברנה החיצונית של המיון ולהכיל TG לאחרונה מסונתז הטרייה ER-derived חומצות שומן בחינם11. עם זאת, נותר לא ידוע אם ליפידים במאגר באד, להישאר מחובר, או הדליות ה ER6,11, שהופך את ניתוקה של תעודות זהות ללא מיון טכנית מאתגר. חומצות שומן בחינם מנחים של תעודות זהות על-ידי הפעולה של פני השטח lipases כדי לספק ייצור אנרגיה או קרום סינתזה. בנוסף, LDs יכול להיות מושפל ויה lipophagy בתור מנגנון רגולטורי וכדי לייצר חומצות שומן בחינם12.

מלבד ER lysosomes, ישנם אחרים organelles — כגון המיטוכונדריה, endosomes, peroxisomes וקרום פלזמה — זה נמצאים בתוך האגודה קרוב של LDs11. פוליגמיה חזק זה מקשה לבצע מיצוי טהור של LD. עם זאת, צפיפות נמוכה מולדת של ליפידים נייטרלי ניתן לקחת לנצל באמצעות צנטריפוגה5.

באופן מסורתי, LDs היו מבודדים באמצעות סוכרוז דחיסות צבע1,5,13. עם זאת, שיטות אלה לא תוכננו כדי לבודד organelles אחרים. בנוסף, הם דורשים את הכנת ריאגנטים גוזלת זמן. פרוטוקול זה מסתגל של בידוד בחדר המיון זמינים מסחרית קיט (ראה את הטבלה של חומרים) כדי לאפשר בידוד LD. אנו משתמשים המאגר שאיבה שסופק על-ידי ערכת, הוספת שלב בידוד LD. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש גם עבור מיון ובידוד lysosomal באמצעות הדגימות אותו, ומאפשר תמונה מקיפה יותר של מחזור החיים של תעודות זהות. לאימות שיטה חדשה, אנחנו assay LD התשואה, מורפולוגיה, לגודל ו טוהר. אנו משווים את התוצאות המובאות לאלו שהושגו עם פרוטוקול נפוץ ניצול הדרגתי סוכרוז לבידוד LD.

השתמשנו של 10 עד 12-בת, 20 גרם הנשי C57BL/6 העכבר התענה עבור 16 h (הסרת מזון בשעה חמש בערב במשך תקופה של בידוד LD 9.00 A.M.) עם גישה חופשית למים. התשואה טיפוסי של TG 0.6 מ ג/גרם כבד, LD חלבון, זה הכבד 0.25 mg/g. זה מספק מספיק חומר immunoblots ~ 10 מאת דף מרחביות. הפרוטוקול להלן הפרטים ריאגנטים בשימוש, פרוטוקול מתאים כבד יחיד 1 g. פרוטוקול בידוד הדרגתיות סוכרוז מותאמת של סאטו14 ו וו15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים נערכו על ספסל מעבדה עם ציוד מגן אישי המתאים עבור אבטחה רמה 1, כולל חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפי מגן. הניסויים בוצעו לפי הפרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת פנסילבניה. נעשה כל מאמץ כדי למזער את אי נוחות בעלי חיים, בעלי החיים היו בכבוד אנושי.

1. LD בידוד באמצעות ערכת בידוד בחדר המיון

  1. הכנה
    הערה: הכמויות המפורטות מתאימים יחיד 1 g העכבר כבד.
    1. הכן 10 מ ל x 1 חילוץ מול מאגר (IE מאגר, הערכה בידוד ER) על ידי דילול 2 מ של מאגר IE x 5 עם 8 מ ל מים הנדסה גנטית. מגניב המאגר על-ידי הצבתו על קרח.
    2. הכן 100 מ של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על ידי דילול 10 מ"ל של 10 x PBS ב 90 מיליליטר מים הנדסה גנטית. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    3. הכן 10 מ"ל של האתר-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl p. 5% פוליאתילן גליקול (PGPE) על ידי µL 500 המדללת של PGPE ב 9.5 מ ל מים הנדסה גנטית. השתמש מזרק 1 מ"ל למדוד את PGPE כפי שהוא צמיגה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    4. מגניב לכל הצינורות על ידי הצבת אותם על קרח: 1.7 mL microcentrifuge צינורות, צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, 50 מ ל צנטריפוגה במהירות גבוהה צינורות, צינורות ultracentrifuge מ"ל 13.
    5. מגניב כל הנדרש צנטריפוגות 4 ° c: microcentrifuge, צנטריפוגה בקיבולת גבוהה עבור 15 מ"ל צינורות, צנטריפוגה במהירות גבוהה עבור צינורות 50 מ ל, ultracentrifuge.
    6. לחטא מלקחיים, חיתוך מספריים על-ידי autoclaving.
  2. הכנת הרקמה
    1. המתת חסד את העכבר על-ידי הצבתו בחדר מלא 100% CO2 עבור 10 דקות אישור המתת חסד על-ידי ביצוע נקע בצוואר הרחם.
    2. שימוש סטרילי מלקחיים ומספריים חיתוך, לחתוך את שכבות העור והשריר של הבטן על הציר הקדמי/אחוריים כדי לחשוף את הכבד.
    3. חותכים את הרצועות מתחבר הכבד הסרעפת ואת המעי. להשתמש מלקחיים למשוך המעי מן הכבד, לכיוון האחורי, כדי לחשוף את הרצועות.
    4. לחתוך בין הכבד קשת הצלעות הגבי, נע והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה עד הכבד משוחרר.
    5. להעביר את הכבד קר 5 ס צלחת פטרי עם 10 מ"ל של PBS קר 1 x.
    6. לשטוף את הכבד 2 x על פלטפורמה נדנדה ב- 10 מ"ל של PBS קר 1 x עבור 5 דקות ב 4 ° C ב- 5 ס מ פטרי. יוצקים את 1 x PBS לאחר כביסה הסופי.
    7. להשתמש בלהב כירורגי סטרילי גודל 10 (ראה הטבלה של חומרים) כדי קוביות הכבד לחתיכות 3-5 מ מ ב- 5 ס מ פטרי (איור 1 א').
    8. לשטוף את הכבד קצוץ 2 x עם 10 מ"ל של PBS קר 1 x עבור 5 דקות ב 4 ° C ב- 5 ס מ פטרי.
      הערה: בידוד ליזוזום, להעביר 0.5 גר' כבד מהמגן 45 מ ל נקי, בצע את ההוראות שסופקו על ידי החילוץ ליזוזום קיט (ראה את הטבלה של חומרים).
    9. Decant 1 x PBS ולהעביר את חתיכות כבד קצוץ קר 45 מ ל דאונס מהמגן. ודא שכל החלקים נלך לתחתית מהמגן.
    10. הוסף mL 7 קר 1 x מאגר IE (מתוך ערכת בידוד ER), homogenize על הקרח על ידי הזזת את שהעקב לאורך 20 x. ודא כי איחדו מגיע לתחתית מהמגן במהלך כל קו.
    11. להעביר את homogenate (איור 1B) שפופרת צנטרפוגה קר 15 מ"ל.
    12. לשטוף את מהמגן עם 1 מ"ל של קר 1 x מאגר IE (מתוך ערכת בידוד ER), להוסיף את זה לשאר homogenate.
  3. בידוד LD
    1. להסיר גרעינים על ידי צריך שתוציאו את homogenate ומפרידה בקיבולת גבוהה ב x 1000 g 10 דקות ב 4 ° C (איור 1C).
    2. להעביר את תגובת שיקוע postnuclear (מערכת העצבים ההיקפית) שפופרת צנטרפוגה חדש, קר 50 מ. כדי למנוע אובדן LD, ודא כי כל השומנים התאספו בחלק העליון של הצינור 15 מ"ל הוא resuspended לפני העברת את מערכת העצבים ההיקפית.
    3. לקחת את µL 100 aliquot של מערכת העצבים ההיקפית לניתוח טוהר ולמקם אותו בצינור microcentrifuge mL 1.7 קר. תתעלם מזה. על הקרח.
    4. כדי להסיר את המיטוכונדריה, centrifuge המדגם מערכת העצבים ההיקפית, לא aliquot, קירור ומפרידה במהירות גבוהה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
      1. אופציונלי: LD גולמי (המשטרתי) מבודד (עם ציטוזול וזיהום קרום התא), לאסוף את השכבה העליונה השומנים בעזרת פיפטה מזכוכית ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.7 מ. המשך סעיף 1.4.
    5. להעביר את תגובת שיקוע postmitochondrial (PMS) צינור ultracentrifuge. כדי למנוע אובדן LD, ודא כי כל השומנים התאספו בחלק העליון הוא resuspended לפני העברת את תסמונת קדם וסתית.
    6. לקחת את µL 100 aliquot המחזור לניתוח טוהר ולמקם אותו בצינור microcentrifuge mL 1.7 קר. תתעלם מזה. על הקרח.
    7. למלא עם צינור ultracentrifuge עד הקצה, לזכותו קר 1 x מאגר IE כדי למנוע את הצינור קורסת במהלך ultracentrifugation.
    8. לאזן את הדגימות, centrifuge אותם ב ultracentrifuge ב 100,000 x g עבור 60 דקות ב 4 ° C (איור 1D).
    9. כדי להסיר את שכבת LD, להטות את הצינור בזווית של 45 מעלות ולהשתמש פיפטה מזכוכית של האחות. העברה בגדר צינור microcentrifuge mL 1.7 קר.
      הערה: בגדר מכיל ER מבודד. השתמש את השבר הזה במורד הזרם לבידוד ER.
    10. לאסוף 100 µL של פוסט-ER תגובת שיקוע (פי) מתחת לשכבת ליפיד לניתוח טוהר.
  4. LD כביסה
    1. להוסיף 1 x PBS השבר LD שליקט צינור microcentrifuge 1.7, את הנפח הכולל של 1.3 מ.
    2. מערבולת המדגם.
    3. צנטריפוגה ב microcentrifuge בשיא המהירות עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה כל שאריות תאים. חממו את הצינור בעדינות בידיים כדי לעזור resuspend את השכבה LD. להעביר את תגובת שיקוע, כולל שהשכבה השומנים, צינור microcentrifuge 1.7 מ.
    4. חזור על צעדים 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, עד בגדר אינה גלויה.
    5. להוסיף 1 x PBS LD ללא גלולה supernatant לאמצעי הסופי של 1.5 מ. לשטוף את השבר השומנים על ידי צנטריפוגה ב microcentrifuge בשיא המהירות עבור 5 דקות ב 4 º C.
    6. הסר 1 מ"ל של PBS x 1 (מתחת לשכבת השומנים) עם פיפטה מזכוכית מבלי להפריע השכבה השומנים.
    7. חזור על שלבים 1.4.5 ו 1.4.6 4 x x-5, עד מגניב 1 x באופן חזותי שקוף עם אין עכירות.
    8. להסיר את כל PBS 1 x מתחת לשכבת השומנים, באמצעות פיפטה של זכוכית (איור 1E).
    9. השתמש את התוצאה, שבריר LD טהור, לניתוח במורד הזרם.
  5. LD כימות חלבונים על ידי assay חומצה bicinchoninic
    הערה: אין להשתמש assay חומצה bicinchoninic (BCA) אם מורפולוגיה LD הוא לפנות לבדיקה.
    1. Resuspend את תעודת הזהות של 500 μL של 5% PGPE.
    2. מרתיחים את הדגימות למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, מערבולת, דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות להתקרר.
    3. חזור על שלב 1.5.2 x 2 נוספים.
    4. Sonicate הדגימות במשך חמש דקות עם בן 30 + s/ביטול מחזור, בעוצמה בינונית.
    5. לנרמל את הדוגמאות על ידי מדידת ריכוז חלבון כל טוהר ניתוח דוגמאות, השבר LD מאת BCA וזמינותו.

2. LD בידוד באמצעות סוכרוז דחיסות צבע

  1. הכנה
    1. להפוך 200 מ ל TE מאגר (10 מ מ טריס-HCl [pH 7.4], 1 מ"מ EDTA [pH 8.0]). מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    2. להפוך 100 מ של 60% (w/v) סוכרוז פתרון במאגר טה על ידי המסת 60 גר' סוכרוז במאגר טה, להביא את עוצמת הקול הסופי 100 מ. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    3. להפוך 6 מ של 40% (w/v) סוכרוז פתרון על-ידי הוספת מ 4 ל 60% סוכרוז 2 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    4. להפוך 6 מ של 25% (w/v) סוכרוז פתרון על-ידי הוספת 2.5 מ של 60% סוכרוז 3.5 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    5. להפוך 4 מיליליטר 10% (w/v) סוכרוז הפתרון על-ידי הוספת מ 0.7 ל 60% סוכרוז mL 3.3 מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    6. להפוך 10 מ"ל של פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז על-ידי הוספת טבליה אחת של מעכבי פרוטאז והן פוספטאז 10 מ"ל טה המאגר.
    7. להכין מאגר homogenate רקמות על-ידי הוספת 4 מיליליטר פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז 50 מ של 60% סוכרוז פתרון מניות. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    8. להכין מאגר כיסוי על-ידי הוספת 2 מ של פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז 50 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    9. הכן 100 מ של 1 x PBS על ידי דילול 10 מ"ל של 10 x PBS ב 90 מיליליטר מים הנדסה גנטית. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    10. הכינו 10 מ"ל של 5% PGPE על ידי µL 500 המדללת של PGPE ב 9.5 מ ל מים הנדסה גנטית. השתמש מזרק 1 מ"ל למדוד את PGPE כפי שהוא צמיגה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.
    11. מגניב הצינורות צנטריפוגה הבאות על-ידי הצבתם על הקרח: 1.7 mL microcentrifuge צינורות, צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, 50 מ ל צנטריפוגה במהירות גבוהה צינורות, צינורות ultracentrifuge מ"ל 13.
    12. מגניב של צנטריפוגות נדרשים 4 ° c: microcentrifuge, צנטריפוגה בקיבולת גבוהה (עבור צינורות 15 מ"ל), צנטריפוגה במהירות גבוהה (עבור צינורות 50 מ ל), של ultracentrifuge.
  2. הכנת הרקמה
    1. השתמש 1.2.1–1.2.9 צעדים כדי להתכונן הרקמה המגון.
    2. להוסיף 7 מ של מאגר homogenate רקמות קר, homogenize זה על קרח. על-ידי הזזת את שהעקב לאורך 20 x. במהלך הסטרוקס חמישה, ודא שאיחדו מגיע לתחתית מהמגן.
    3. להעביר את homogenate שפופרת צנטרפוגה קר 15 מ"ל.
    4. לשטוף את מהמגן עם 1 מ"ל של רקמות קר homogenate מאגר, להעביר אותו הצינור צנטריפוגה השתמשו בעבר 15 מ"ל.
    5. להביא את עוצמת הקול של homogenate עד 10 מ"ל עם רקמת homogenate מאגר.
    6. Centrifuge המדגם ומפרידה בקיבולת גבוהה ב x 1000 g 10 דקות ב 4 º C.
    7. העברה 8 מ של תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה 50 מ.
    8. העברת µL 100 של תגובת שיקוע הנותרים כדוגמה מערכת העצבים ההיקפית לניתוח טוהר.
  3. סוכרוז הדרגתי
    1. להטות את הצינור צנטריפוגה 50 מ ל המכיל mL 8 של מערכת העצבים ההיקפית בזווית של 45°. להוסיף בזהירות 6 מ של 40% סוכרוז פתרון, המבטיח שני השלבים להישאר נפרדים.
    2. באופן דומה, לאט להוסיף 6 מ של 25% סוכרוז פתרון; לאחר מכן, הוסף 4 מיליליטר 10% סוכרוז הפתרון; לבסוף, להוסיף 8 מ של שכבת-העל של המאגר.
    3. Centrifuge המדגם ומפרידה במהירות גבוהה ב x 30,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    4. להעביר את השכבה העליונה המכיל את LDs לרכבת התחתית microcentrifuge 1.7 מ.
    5. לרחצה LD, בצע את השלבים בסעיף 1.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יש לבצע את הבידוד LD עם הקיט מיון על עכברים כ-30 ואנו והשוו את התוצאות עם אלה בעקבות פרוטוקול בידוד סוכרוז על 40 עכברים. הממצאים שדווחה אופייניות עבור פרוטוקולים. עכברים היו התענה בין לילה עם גישה חופשית למים, להגברת LD. LD בידוד באמצעות הדרגה סוכרוז היה לפעול במקביל עם ערכת ER LD בידוד פרוטוקול. דוגמאות של מערכת העצבים ההיקפית, PMS, לכל, CLDs ו- LDs שנאספו ברחבי ערכת ER LD בידוד פרוטוקול. עקב מגבלת זרימת העבודה של פרוטוקול בידוד סוכרוז, נאספו רק מערכת העצבים ההיקפית, LD המבודד.

עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, µL 50 של LDs מבודד היו מעורבים עם אמצעי אחסון שווה של 100 מיקרומטר 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). הדגימות היו מוגנים מפני אור, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הדגימות נשטפו על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS 1 x, ואחריו צנטריפוגה והסרה של מאגר עודף. של השבר LD, 1 µL הונח על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם coverslipped. נציג 20 x פלורסנט ותמונות LD brightfield נלקחו מן הבידוד ערכת LD ER והן את הבידוד סוכרוז LD שיטות (איור 2 א-ד), שימוש במיקרוסקופ מחקר הפוך (ראה את הטבלה של חומרים). הדימויים brightfield לחשוף רמות דומות של חלקיקי החומר, רומז purities דומה באמצעות פרוטוקולים שונים.

כדי לקבוע את ההבדלים התשואה בין שני הפרוטוקולים, השתמשנו עכברים וזהובה בינוניים וכבדים העכבר (איור 2EF). רמות הבאות של טיהור, LD TG וחלבון נמדדו באמצעות מבחני ערכי צבע מוחלטים (ראה את הטבלה של חומרים), הנתונים היו מנורמל למשקל כבד (איור 2GH). מצאנו, כאשר אנחנו מנורמל חומר המוצא, כי חלבונים LD ו- TG תשואות לאחר בידוד LD באמצעות ערכת ER, סוכרוז היו דומים. כדי לקבוע אם גודל LD היה גם דומה, אנחנו לכמת קטרים LD באמצעות תוכנת ניתוח התמונה (ראה את הטבלה של חומרים). LDs נע בין 0.27 6.37 מיקרומטר. התפלגות השכיחויות של LD קוטר מראה כי בידוד ערכת LD ER (איור 3 א) ובידוד LD סוכרוז (איור 3B) תשואה LDs בגדלים דומים.

כדי להעריך LD טוהר, הדגימות היו לבדיקה על ידי immunoblotting. כמות של 20 µg של חלבון ליום המדגם היה לבדיקה על ידי דף מרחביות. הדגימות היו שנבדק עם סימני נוגדנים LDs (PLIN2 ו- PLIN3), ER (Sec61), המיטוכונדריה (VDAC), lysosomes (LAMP1), קרום פלזמה (MEK1), גרעינים (היסטון H3) של ציטוזול (GAPDH) (איור 4A). PLIN2 התגלתה בדגימות כל פרט ערכת ER LD בידוד לכל, מערכת העצבים ההיקפית של סוכרוז. LDs נגזר ערכת ER LD בידוד והיה סוכרוז הדרגתיות בפרוטוקול הן טוהר שווה. להקות הופיעו המיון (Sec61), המיטוכונדריה (VDAC1), lysosomes (LAMP1), קרום פלזמה (Mek1) או את ציטוזול (GAPDH). למחלקה לחקירות היה קרום פלזמה ציטוזול זיהום אך אין חשש לזיהום לכאורה חדר המיון, המיטוכונדריה או lysosomes. האינטנסיביות של הלהקה PLIN2 בפרוטוקול מיון מותאם מציין כי הפרוטוקול חדר המיון היה ביטוי PLIN2 גבוה כ 14-fold השבר LD לעומת את מערכת העצבים ההיקפית, בעוד הפרוטוקול סוכרוז היה ביטוי PLIN2 גבוה יותר sixfold (שבר תעודת הזהות נתונים לא מוצג).

כי פרוטוקול זה יש גם את האפשרות לטהר ER ו- lysosomes, ביצענו גם סופג המערבי כדי להעריך את הטוהר של האלה organelles. איור 4B מראה כי immunoblots של ER מטוהרים מדגם זהה באמצעות המיון קיט (ראה את הטבלה של חומרים) היו חופשיים מכל PLIN2 אך רמות משמעותיות של החלבון ER Sec61A. באמצעות את העשרת lysosomal קיט (ראה את הטבלה של חומרים), lysosomes היו יותר מבודדים, immunoblotted LD (PLIN2), ER (Sec61A) של סמנים ליזוזום (LAMP1) (איור 4C). יחד, נתונים אלה מראים את פרוטוקול המובאים כאן, בשילוב עם ערכות טיהור ליזוזום זמינים מסחרית, לאפשר הבידוד טהור של הכבד LDs, ER ו lysosomes מחיה יחיד.

Figure 1
איור 1: הפניה תמונות שצולמו במהלך LD בידוד באמצעות ערכת בידוד בחדר המיון . (א) כבד קצוץ 5 מ"מ חתיכות 5 ס מ פטרי. (B) homogenate הכבד לאחר המגון ב מהמגן דאונס. (ג) homogenate הכבד לאחר צנטריפוגה ב 1,000 x g; הערה השכבה השומנים קלה על העליונה, את מערכת העצבים ההיקפית של גלולה המכילה שאריות תאים, השבר הגרעין. (ד) תעודת זהות שכבת לאחר ultracentrifugation ב x 100,000 g; הערה השכבה השומנים בולטים על העליונה, לכל את השבר ER בתחתית. (E) Washed LD שבר לפני ההסרה הסופית של טוב, מגניב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Micrograph וניתוח כמותי השוואת השבר LD מבודדת עם ערכת ER לבין השבר LD מבודדת עם סוכרוז. נציג 20 x micrograph פלורסנט (A) שבר LD שהוכתמו DPBDI מבודדים עם ערכת ER ו LDs (B) מבודד עם סוכרוז. (ג) Brightfield micrograph של השבר LD מבודדת עם ערכת ER ו (D) השבר LD מבודדת עם סוכרוז. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (E) משקל העכבר ו (F) משקל כבד. התשואה (G) TG LDs מטוהרים מנורמל למשקל כבד. חלבון (H) תשואה של LDs מטוהרים מנורמל למשקל כבד. זאת אומרת ± SEM נמצאים הנתונים (N = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: התפלגות השכיחויות בגדלים LD. דגימות ארבעה עכברים שונים היו מוכתמים DPBDI ונציג x 20 שדות היו לכמת. הקוטר נמדדו באמצעות תוכנת ניתוח של התמונה. (א) חלוקת תדר (שבר) שבר LD מבודדים באמצעות ערכת ER. (B) חלוקת תדר (שבר) שבר LD מבודדים באמצעות צפיפות הדרגתיות סוכרוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: ניתוח של LD טוהר מאת immunoblotting. (א) להשוות את הפרוטוקול מותאם בידוד ערכת LD המיון ואת פרוטוקול בידוד סוכרוז, 20 µg של חלבון ליום המדגם היה immunoblotted. הדוגמאות הבאות היו טעונים: תגובת שיקוע postnuclear (מערכת העצבים ההיקפית), תגובת שיקוע postmitochondrial (PMS), רשת postendoplasmic תגובת שיקוע (פי), גולמי LDs (המחלקה לחקירות) ו LDs (LD). הדגימות היו immunoblotted עבור LDs (PLIN2 ו- PLIN3), ER (SEC61A), המיטוכונדריה (VDAC1), ליזוזום (LAMP1), קרום התא (MEK1), גרעינים (היסטון H3) וסמנים ציטוזול (GAPDH). (B) טוהר ניתוח שבר המיון לאחר טיהור נוסף של המיון באמצעות בידוד ערכת LD ER פרוטוקול (ראה את הטבלה של חומרים). מערכת העצבים ההיקפית, PMS, ER ולאחר LDs היו טעונים ו immunoblotted עבור LDs (PLIN2) ואר (SEC61A). (ג) טוהר ניתוח של שבר lysosomal לאחר טיהור נוסף של lysosomes באמצעות ערכת העשרה ליזוזום פרוטוקול (ראה את הטבלה של חומרים). מערכת העצבים ההיקפית, שבר lysosomal היו טעונים, immunoblotted LDs (PLIN2), ER (SEC61A) של lysosomes (LAMP1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ביולוגיה LD הכבד יותר ויותר להיות מזוהה הרגולטור קריטי של hepatocellular הפיזיולוגיה על בריאות ומחלה. כמו organelles בתום-לב, LDs הם דינמיים, אינטראקציה עם מבנים אחרים התאית, להכיל בתוך אותם רכיבים ביו-אקטיביים מעורב הומאוסטזיס השומנים והן גלוקוז. מעבר הצבע סוכרוז באופן שגרתי משמש לבידוד LD ומאפשרת החוקרים ללמוד את מבנה LD, אבל זה דורש מהם לבצע מאגרים רבים. הראו כי השימוש של ערכת זמינים מסחרית של בידוד בחדר המיון הוא כלי נוסף שיכול לשמש לא רק LD בידוד אבל טנדם בידוד של ER ו ליזוזום, המאפשר תצוגה מקיפה יותר של דינמיקה סלולר בתגובה משתנה תנאים ניסיוני, ללא עלייה משמעותית בזרימת העבודה.

הכוח של פרוטוקול חדש זה הוא קלות התקנה באמצעות מסחרית או נוגדנים זמינים ואת יכולתו לבודד organelles מרובים בו-זמנית. עם זאת, ישנם החסרונות פוטנציאל לשיטה חדשה זו לזכור. מספר שלבים של פרוטוקול זה ייתכן חסרון בידודו של סאפארסיזאד ייצרו LDs מן הכבד. דאונס המגון יש פוטנציאל לשבש LDs גדול באמצעות גזירה. מתאים באופן רופף דאונס מהמגן ההתקנה עשויה להקל על חלק מן הלחץ כדי LDs גדול. בנוסף, 100,000 x g ספין הוא מועסק, המאפשרות ההפרדה של LD ו- ER. מהירות זו עלולים גם הם לגרום לאובדן של LDs גדולים, כמו אחד ממליץ x 2,000 g עבור טיהור הכבד של LD2. מגבלה אחת של הליך זה היא כי זה לא יכול לשמש כדי לבודד LDs בגדלים שונים כמו תיאר לאחרונה16. בנוסף, למרות סוכרוז מאגרי יכול לשמור LDs שביר שלם באמצעות המגון עדין2, homogenizing עם מאגר IE x 1 התשואות LDs טהור עם מורפולוגיה דומה והפצה גודל כמו אלה נגזר בידוד הדרגתיות סוכרוז . מחקר נוסף, יהיה צורך לקבוע אם הפעילות הביולוגית מושפע על ידי שימוש מאגר PBS, שהינו פחות עדין יותר נפוץ מאגרי מול2. בשל מגבלות אפשריות אלו, זה קריטי במהלך השלבים צנטריפוגה שני הראשונים כדי resuspend באופן מלא את השומנים שנאספו בראש לפני העברת תגובת שיקוע וכדי לקבוע מדעית באפקט של המספר לשבץ התשואה LD עבור שונים רקמות. פרוטוקול כבד המובאת כאן משתמש קווים 20, מניב התפלגות גודל דומים אחרים שפורסמו עבודה2.

LD בידוד באמצעות ערכת בידוד רשתית תוך-פלזמית התשואות מבודד LD גולמי והן טהור. למצ ח מבודד מכיל קרום התא ורכיבים ציטוזול אך יוכיח מספיק עבור יישומים מסוימים, כגון הערכת LD מורפולוגיה עם מיקרוסקופ. בידוד LD טהור, כפי שנקבע על ידי ביטוי PLIN2, חסרה ER, קרום התא מיטוכונדריאלי, lysosomal, או ציטוזול זיהום. ואכן, בידוד טהור הערכה ER LD בידוד פרוטוקול מעשיר PLIN2 יותר מאשר כפולה לעומת שיטת בידוד סוכרוז LD. הבדל זה היה לא צפוי, בהתחשב הדמיון חלבון, TG תשואות, אך ייתכן עקב השימוש של PBS מאגר resuspension בניגוד סוכרוז או מול מאגר.

LD בידוד באמצעות שיטות מסורתיות עלולים לסבול גם מפני זיהום של השבר LD על ידי קרום פלזמה2. למרות הבידוד שיתוף שכיחה אצל כל שיטות בידוד LD יש לשמור בראש בעת ניתוח מבודד LD2, הנתונים המוצגים כאן מדגימים את ultracentrifugation נוספת של בידוד למצ ח מפסולת המדגם של מזהמים כגון ( איור 4). עיבודים בעתיד יכול לכלול את השימוש מכבש צרפתי או חנקן פצצה כדי לשבש את קרום התא יותר בעדינות ו לצמצם עוד יותר את כל זיהום המשטרתי לבודד2.

לסיכום, ערכת ER שיטת בידוד LD הוא יישום הרומן של כלי נפוץ ביולוגיה תאית. שיטה זו מבצעת באופן דומה לבידוד הדרגתיות סוכרוז, עם הכנה ריאגנט פחות. בנוסף, ההכללה של ריאגנטים מוכן בערכה ER LD בידוד פרוטוקול משפר את הקשיחות ואת הפארמצבטית של תנאי הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד ר קאר מקבל תמיכה במחקר תרופות ליירט.

Acknowledgments

אנו מודים במכון לחקר סרטן משפחת אברמסון. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים הבאים: R01 NIH/NIAAA AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, רוברט ווד ג'ונסון קרן, הרולד עמוס רפואי פיתוח פרס הפקולטה, 7158, IDOM הרפובליקה הדמוקרטית של קונגו טייס פרס P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (ג'יי). עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי NIH P30-DK050306 ולהעניק במתקניה הליבה (פתולוגיה מולקולרית, הדמיה הליבה בביולוגיה מולקולרית/ג'ין הביטוי ליבה, תא תרבות הליבה) וטייס התוכנית. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 146 השומנים droplet בידוד כבד perilipin 2 רשתית תוך-פלזמית סוכרוז מיצוי הדרגתי מול מאגר
השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettschneider, J., Correnti, J. M., … More

Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter