De afleiding van een Flavonol is cruciaal voor de toepassing ervan in de gezondheidszorg en de voedingsindustrie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de biosynthese van een Flavonol van een flavanone en bespreken de cruciale stappen en de voordelen ervan ten opzichte van andere benaderingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Biosynthese van een Flavonol van een Flavanone door het opzetten van een One-pot Bienzymatische Cascade
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Flavonolen zijn een belangrijke subklasse van flavonoïden met een verscheidenheid aan biologische en farmacologische activiteiten. Hier, we bieden een methode voor de in vitro enzymatische synthese van een Flavonol. In deze methode worden Atf3h en Atfls1, twee belangrijke genen in de biosynthetische route van de flavonolen, gekloond en overexpressie in Escherichia coli. De recombinant enzymen worden gezuiverd via een affiniteits kolom en vervolgens wordt een bienzymatische Cascade vastgesteld in een specifieke synthetische buffer. Twee flavonolen worden gesynthetiseerd in dit systeem als voorbeelden en bepaald door TLC-en HPLC/LC/MS-analyses. De methode geeft duidelijke voordelen in de afleiding van flavonolen over andere benaderingen. Het is tijd-en arbeidsbesparing en zeer kosteneffectief. De reactie is gemakkelijk om nauwkeurig te worden gecontroleerd en dus opgeschaald voor massaproductie. Het doel product kan gemakkelijk worden gezuiverd door de eenvoudige componenten in het systeem. Echter, dit systeem is meestal beperkt tot de productie van een Flavonol van een flavanone.
Inleiding
Flavonolen zijn een belangrijke subklasse van planten flavonoïden en zijn betrokken bij de ontwikkeling van planten en pigmentatie1,2,3. Belangrijker, deze verbindingen bezitten een breed scala van gezondheid-heilzame activiteiten, zoals anti-kanker4,5, anti-oxidatieve6, anti-inflammatoire7, antiobesity8, anti-hypertensieve9 , en geheugen terugroepen eigenschappen10, wat leidt tot een groot aantal st....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Isoleer totaal RNA uit plantenweefsels26,27
- Homogeniseren de plantenweefsels.
- Verzamel 100 mg van een vers plantenweefsel (bijv. 4 weken oude zaailingen uit Arabidopsis thaliana). Vries het weefsel en een stamper en mortel met vloeibare stikstof, gevolgd door het slijpen van het weefsel in poedervorm.
- Voeg 1 mL RNA-isolatie reagens (Zie tabel met materialen) toe aan de mortel. Het reagens wordt onmiddellijk bevroren. Homogeniseren het weefselmonster met de stamper wanneer het bevroren reagens smelt.
- Breng het homogenaat over in een buis van 1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
F3H en FLS1 zijn twee belangrijke sleutel enzymen bij de omzetting van een flavanone in een Flavonol in planten, zoals weergegeven in Figuur 1. Voor de ontwikkeling van een in vitro biosynthetisch systeem voor de productie van een Flavonol uit een flavanone, Atf3h (GenBank toetredingsnr. NM_ 114983.3) en Atfls1 (GenBank toetredingsnr. NM_ 120951.3) genen werden gekloond uit de zaailingen van 4 weken oude a. thaliana in een prokaryot.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een flink aantal studies zijn gericht op de afleiding van flavonolen als gevolg van hun potentiële toepassing in de gezondheidszorg en voedingsmiddelenindustrie. Echter, traditionele planten extractie met behulp van organische oplosmiddelen en chemische synthese bezitten intrinsieke nadelen, die hun gebruik in de productie van flavonolen beperken. Hier rapporteren we een gedetailleerde methode voor het produceren van een Flavonol van een flavanone in één pot door het opzetten van een in vitro bienzymatische Cascade. De k.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel gesteund door de Universiteit van Yangzhou, speciaal benoemd professor start-up funds, Jiangsu speciaal benoemd professor start-up funds, Six talent Peaks project in de provincie Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016), en een project gefinancierd door de prioritaire academische programma ontwikkeling van de Jiangsu hogeronderwijsinstellingen (diergeneeskunde). We danken het testcentrum van de Universiteit van Yangzhou voor HPLC en MS-analyses van flavonoïden.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR-amplificatie van genen met hoge trouw |
| Agilent 1200 Series RRLC systeem met een Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS systeem | Agilent Technologies, Inc | N/A | een apparaat voor analyse van flavonoïden door HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (versie B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | een software voor het verzamelen van gegevens van het Agilent 1200 Series RRLC systeem met een Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS systeem |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | tussenproduct voor het produceren van kaempferol uit naringenin |
| dihydroquercetine | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | tussenproduct voor het produceren van quercetine uit eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | zuivering van PCR-versterkte of gel-gezuiverde DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substraat voor het produceren van quercetine |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteriestam voor het tot expressie brengen van doelgenen |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteriestam voor plasmideproliferatie |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | een apparaat voor het lyofiliseren van in organisch oplosmiddel opgeloste flavonoïden |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | zuivering van een DNA-band van een agarosegel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 | een apparaat voor visualisatie van DNA-band op een agarosegel of flavonoïde vlek op een polyamide TLC-plaat |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparatie van plasmiden |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | uiteindelijk reactieproduct en standaardsubstantie |
| MassHunter Quanlitative Analysis (versie B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | een software voor analyse van HPLC/LC/MS-gegevens |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | een apparaat voor bepaling van DNA/RNA-concentratie |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substraat voor het produceren van kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | zuivering van His-tagged fusie-eiwitten |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmide voor het klonen en tot expressie brengen van doelgenen |
| plasmide sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing van recombinante plasmiden |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthese van PCR-primers |
| quercetine | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | uiteindelijk reactieproduct en standaardsubstantie |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthese van de eerste streng van cDNA van totaal RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligatie van een insert in een gelineariseerd vector-DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolatie van totaal RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | een software voor PCR-primerontwerp en DNA-sequentieanalyse |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | een software voor analyse van HPLC-gegevens |
Referenties
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Cha....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
