Summary
ביויודים מורכבים באופן מורכב מארכיטקטורות מורכבות ומתפתחות לדפוסי מרחבי מאוד תלויי קנה מידה. כאן, אנו מציגים מערכת ניסיונית (קשה ותוכנה) עבור רכישה אוטומטית של מערכות הנתונים של טומוגרפיה אופטית 3D קוהרנטית (OCT). ערכת כלים זו מאפשרת אפיון לא פולשני ורב-ממדי של הביוגנזה מורפוליולוגיה במרחב ובזמן.
Abstract
ביואילאמים הם אורח חיים מוצלח ביותר בחיידקים ומנצח בהמון הגדרות סביבתיות ומהונדסים. הבנת המבנה הקונסטרוקטיבי של ביואוגנזה, שהיא הגיוון המבני של ביוילאמים במהלך האסיפה הקהילתית, מייצגת אתגר יוצא דופן על פני קשקשים מרחביים וזמני. כאן, אנו מציגים מערכת הדמיה אוטומטית של ביואוilm המבוססת על טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT). OCT היא טכניקת הדמיה מתפתחים בתחום המחקר הבין-מחקרי. עם זאת, כמות הנתונים שניתן לרכוש כרגע ולעבד הסלים את הסקנה הסטטיסטית של דפוסי בקנה מידה גדול בתוך המבנה הבין-מורפולוגיה. מערכת ההדמיה האוטומטית של OCT מאפשרת לכסות את היקף הריבוי והארוך של צמיחת הביוilm. הוא משלב מערכת מסחרית הזמין OCT עם פלטפורמת מיצוב רובוטית וחבילת פתרונות תוכנה כדי לשלוט על המיקום של בדיקה סריקת OCT, כמו גם רכישת ועיבוד של ערכות נתונים 3D הדמיה של ביוilm. התקנה זו מאפשרת באתרו ובמעקב אוטומטי לא פולשנית של פיתוח הביוilm וניתן לפתח עוד ליצירת הדמיה של שני OCT עם מאקרוצילום ופרופיל מיקרוסנסור.
Introduction
ביואילאמים הם הסתגלות מוצלחת ביותר לסגנון חיים של חיידקים והקהילות הללו הקשורות ומטריצה משולבת של מיקרואורגניזמים להשתלט על החיים מיקרוביאלית בהגדרות טבעיות ותעשייתיים1,2. שם, ביוגיאמים יוצרים ארכיטקטורות מורכבות, כגון סרטים מאורכים3, אדוות4 או פטריות כמו כמוסות מסוג5 עם השלכות חשובות לגידול ביוilm, יציבות מבנית ועמידות ללחץ6. בעוד הרבה מאוד על בידול מבנית לומדים מהעבודה על תרבויות מונו-מינים גדל בתאי זרימה זעירים, רוב הביואמים הם קהילות מורכבות לעתים קרובות כולל חברים של כל תחומי החיים6. מעריך את הביואמים המורכבים הללו כנופי מיקרוביאלית7 ומבינים כיצד מבנה ותפקוד של ביוilm מקיימים אינטראקציה בקהילות מורכבות, ולכן בחזית המחקר של הביו,.
הבנה מכניסטית של מורפוגנזה של ביווריאמים מורכבים בתגובה לרמזים סביבתיים מחייבת ניסויים מעוצבים בקפידה בשילוב עם תצפיות הקשורות באופן זמני ומעמיק של מבנה פיסי של ביויוסיס על-פני מאזניים8. עם זאת, התבוננות בלתי הרסנית של גידול ביוilm במערכות נסיוניות הוגבלה באופן חמור באילוצים לוגיסטיים, כגון הצורך להעביר דגימות (למשל, למיקרוסקופ), הפוגעות לעתים קרובות במבנה הבין-ממדי העדין.
הפרוטוקול המוצג כאן מציג מערכת אוטומטית לחלוטין מבוסס על טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (OCT), אשר מאפשר את באתרו, לא פולשנית ניטור של ביואוסיס מורגנזה בקנה מידה מזולא (מגוון מ"מ). OCT היא טכניקת הדמיה מתפתחים בתחום המחקר של הארגון, עם יישומים בטיפול במים ומחקר ביומיים, רפואה9 ואקולוגיה של זרם10. ב-OCT, מקור אור קוהרנטיות נמוך מפוצל למדגם וזרוע התייחסות; הפרעה של האור המשתקף והתפזרו על-ידי היוilm (הזרוע המדגם) והאור של זרוע ההתייחסות מנותח. סדרה של פרופילים בעלי עוצמה צירית (A-סריקות) אשר מכיל מידע מבני הנפתרות בעומק מעמיק נרכש וממוזג לתוך סריקת B (חתך רוחב). סדרה של B-סריקות סמוכות מלחינה האחרון 3D לסרוק את העוצמה10. OCT מספק רזולוציה אופטית לרוחב בטווח של כ 10 יקרומטר ולכן מתאים במידה רבה ללמוד בידול מבניים מזוסקופי של ביוילמס10,12. לתיאור מפורט יותר של OCT, עיין דרקסלר ופוג'ימוטו13ו fercher ועמיתיו14. למרות ששדה-התצוגה של ציר xy אחד של OCT מגיע עד מאות מיקרומטר רבועים, לא ניתן לכמת תבניות בקנה מידה גדול יותר באמצעות OCT בסריקה אחת. ביחס לבייואמים בבתי גידול טבעיים כגון נחלים ונהרות, הדבר מגביל כיום את היכולת שלנו להעריך את המבנה הפיזי והידראולי של בית הגידול.
על מנת לעבור את המגבלות הללו מרחבי ולרכוש באופן אוטומטי בסריקות OCT, בדיקה ספקטרלית בתחום הדמיה OCT הותקן על מערכת מיצוב של 3 צירים. ההתקנה מאפשרת רכישה של מספר סריקות OCT בתבנית פסיפס חופפת (סריקת אריח), השגת ביעילות את ההדמיה הטומוגרפית של שטחי פני השטח עד 100 ס מ2. יתרה מזאת, דיוק המיקום הגבוה של מערכת זו מאפשר לנטר באופן אמין את התפתחותם והתפתחותם של תכונות ביוilm באתרים ספציפיים במהלך ניסויים ארוכי טווח. המערכת היא רכיבים מודולריים ובודדים (כלומר, התקן מיקום ו-OCT) של ההתקנה ניתן להשתמש כפתרונות עצמאיים או בשילוב גמיש. איור 1 מספק מבט כולל על רכיבי התוכנה הקשיחים של ההתקנה.
המערכת נבדקה עם התקן מיקום מסחרי GRBL מבוקרת CNC (טבלת חומרים). מרחקים ההפעלה של פלטפורמת מיקום ספציפית זו הם 600 × 840 × 140 מ"מ, עם יצרן-המצוין בדיוק של +/-0.05 מ"מ ורזולוציה ניתנת לתיכנות של 0.005 mm. GRBL הוא מקור פתוח (GPLv3 רישיון), ביצועים גבוהים תנועה בקרת CNC תקנים. לכן, כל GRBL מבוסס (גירסה > 1.1) התקן מיקום צריך להיות תואם את ההנחיות וחבילות התוכנה המוצגת כאן. יתר על כן, התוכנה יכול להיות מותאם לבקרי מוטוריים אחרים עם סוג הקלט שלב-DIR עם כמה שינויים.
התקן OCT המשמש להערכת ביצועי המערכת (טבלת חומרים) כולל מקור אור קוהרנטיות נמוכה עם אורך גל מרכזי של 930 ננומטר (רוחב פס = 160 nm) והתייחסות מתכווננת באורך ובעוצמה. בדוגמה שהוצגה כאן, נעשה שימוש גם במתאם טבילה לטבילה במכשיר OCT למים זורמים (שולחן החומרים). חבילת התוכנה שפותחה כאן עבור רכישת הסריקה האוטומטית של OCT באופן ביקורתי תלוי ב-SDK סיפק יחד עם מערכת OCT ספציפית, עם זאת, מערכות OCT מאותו יצרן עם עדשות סריקה שונות ואורכי גל מרכזי צריך להיות תואם בקלות.
התקן ה-GRBL נשלט על-ידי שרת אינטרנט המותקן במחשב בעל לוח יחיד (איור 1). זה מעניק שליטה מרחוק של המכשיר מכל מחשב עם רשת מקומית או גישה לאינטרנט. התקן ה-OCT נשלט על-ידי מחשב נפרד, המאפשר לבצע את פעולת מערכת OCT מחוץ לכיוונון הניסיוני האוטומטי. לבסוף, חבילות התוכנה כוללות ספריות כדי לסנכרן מיצוב בדיקה OCT ו-OCT הסריקה לסרוק (כלומר, כדי לרכוש באופן אוטומטי מערכות הדמיה תלת-ממד בתבנית פסיפס או בסדרה של מיקומים מוגדרים). הגדרת המיקום של הבדיקה OCT ב-3D באופן יעיל מאפשר לכוונן את המטוס המוקד במיוחד עבור (אזורי) סטים של סריקות. במיוחד, על משטחים לא אחיד, מטוסי מיקוד שונים (כלומר, תנוחות שונות בכיוון z) ניתן לציין עבור כל סריקת OCT.
ערכה של חבילות תוכנה פותחה כדי לעבד סריקות OCT raw (טבלה 1). ניווט של התקן המיקום, הרכישה של OCT ועיבוד ערכת נתונים מתבצעים עם מחשבים ניידים מקודד פיתון, אשר מאפשרים גמישות יוצאת דופן בפיתוח ואופטימיזציה של התוכנה. שתי דוגמאות עבדו ומבוארות של מחברות כאלה (לרכישת תמונות ועיבוד, בהתאמה) זמינות מ https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git הם מיועדים כנקודות התחלה עבור התאמה אישית של השיטה. מחברת Jupyter הוא דפדפן אינטרנט יישום המבוסס המכילים תאים עם קוד פיתון מסומן. כל שלב מכיל תא של המחברת, שניתן לבצע בנפרד. בשל האורך השונה של נתיב האור דרך עדשת הסריקה (סטייה כדורית)15, סריקות OCT raw מופיעות מעוותות (איור 2a). פיתחנו אלגוריתם כדי לתקן באופן אוטומטי לעיוות זה בסריקות OCT שנרכשו (הכלול בעיבוד imageprocessing ipynb, קובץ משלים 1). יתר על כן, מורפולוגיה ביוilm יכול להיות מדמיין כמפת העלאת 2D, כפי שהיה בעבר בשימוש מערכות ממברנה16, ואנו ממחישים כיצד העלאת מפות שהתקבלו מסריקות שצולמו מערך ריצוף יכול להיות תפור.
לבסוף, את הפונקציונליות של התקנת המעבדה המתוארת מומחש באמצעות ניסוי תעלת שבו phototrophic זרם ביוilm נחשף הדרגתי של מהירות הזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכיוונון של התקן המיקום
- הגדר את התקן המיקום ללוח מיקרובקר, בעקבות ההוראה ב-https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.
- חבר את המיקרו-בקר למחשב בעל לוח יחיד עם חיבור לאינטרנט באמצעות כבל USB והתקן את שרת GRBL כמתואר ב-https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. כעת יש לנווט את מכשיר המיקום מדף אינטרנט המתארח ב-http://IP:5020/. לחילופין, התקן המיקום ניתן לנווט עם סקריפט פיתון, כפי שמתואר בחלק הראשון של הדוגמה העובדת הדפוס המכונה . ipynb (קובץ משלים 2).
2. התקנת OCT
- הר בדיקה OCT למכשיר המיקום באמצעות מחזיק יונה תואם הזנב. במידת הצורך, התקן מתאם טבילה על העדשה האובייקטיבית.
- הצב את המחשב ואת יחידת הבסיס של OCT על ספסל ליד הניסוי (למשל, התקנים מיקרופלואידים, תאי זרימה, פלומס, מערכות סינון). ודא כי הכבל האופטי (אורך מרבי של כ-1.8 מ') נע בחופשיות, מספיק זמן כדי להגיע לכל המיקומים המיועדים ואינו מפריע להתקנה הניסיונית.
- התקן את מערכת OCT יחד עם התוכנה הזמינה כפי שמתואר על-ידי היצרן.
- התקן את חבילות התוכנה עבור רכישת סריקת OCT אוטומטית כמתואר ב-https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.
3. רכישת תמונה
- צריכת חשמל במערכת OCT ובהתקן המיקום. ודא שההתקן יכול לנוע בחופשיות.
- פתח את קובץ config. json בעורך טקסט. ערוך את קובץ config. json כדי להתאים את פרמטר ברירת המחדל של רכישת תמונה (טבלה 2), כגון מדד השבירה (1.33 עבור מים ב-20 ° צ', 1.00 לאוויר) ותיקיית היעד עבור נתונים ומטא-נתונים שנרכשו.
- הגדר את גודל שדה-התצוגה (FOV) ואת מספר הסריקות לסריקת B ב- config. json.
הערה: שני פרמטרים אלה קובעים את גודל voxels של ערכת הנתונים הסופית ואת גודל קובץ הפלט וצריך להתאים את הרזולוציה האופטית של החללית (x-y voxels לא צריך להיות קטן יותר ממחצית הרזולוציה האופטית). המספר של A-ו-B-סריקות משפיע על ההיקף המרחבי להיות מכוסה אשר עסקאות-off כנגד שטח דיסק זמין וכוח עיבוד. - הגדירו את גבולות האות של סריקת OCT של הפלט ב- config. json. הדבר תלוי בסוג המדגם. מומלץ אפוא לקבוע את הפרמטרים הללו בהתבסס על עוצמת היסטגרמות של קבוצה של סריקות ראשוניות. שמור את השינויים ב- config. json.
- נווט את הגשוש של OCT לאתר מעניין. התמקד במדגם והתאם את העוצמה ועוצמת מקור האור לאיכות תמונה אופטימלית. חזור על הליך זה עבור מספר מיקומים ורשום את נקודות הציון.
הערה: פעולה זו תאפשר את רכישת הסריקה האוטומטית של OCT מסביב לנקודות התייחסות אלה. שים לב שאין אפשרות לשנות את אורך ההפניה ואת העוצמה במהלך רכישת תמונה אוטומטית. - פתח את קובץ ה -Imageacquisition. ipynb (קובץ משלים 2) במחברת juypter. כל תא מכיל קוד לביצוע משימות ספציפיות וניתן להפעיל אותו בנפרד באמצעות תא הקשה | הפעלהאו Ctrl + Enter או Shift + enter.
- הגדר את הנתיב לספריות הנדרשות ולפרמטרי התצורה המהווים ברירת מחדל. לחלופין, הגדר קבוצה חדשה של פרמטרים זמניים.
- התחבר להתקן המיקום ואתחל את ה-OCT.
- כיול את התקן המיקום (כלומר, בצע "ביות").
- לרכוש את ערכות הנתונים המכסים את מיקומי האינטרסים בתבנית יחידה לסריקה או פסיפס, לציון המספר והחפיפה (לדוגמה, 30%) של אריחים שכנים.
הערה: הזיכרון מוקצה לפני הסריקה, אשר ממטבת את השימוש במשאבי מחשב. הנתונים נשמרים ב-8 סיביות * בתבניתraw כדי לחסוך שטח אחסון, לתיקיית היעד המוגדרת ב -config. json, באמצעות חותמת הזמן והמיקום כמוסכמה למתן שמות (כלומר,% Y% m% D_% H% m% < S_ מיקום >). מטא-נתונים כולל הגדרות OCT והקואורדינטות נשמרות באותה תיקיה בקובץ *. srm עם אותה מוסכמה למתן שמות. בהתאם להגדרות כגון FOV ורזולוציה, גודל הקובץ עשוי להגיע עד 1.5 ג'יגה-בתים לכל בדיקת OCT.
- כדי למנוע הפלה של רכישת נתונים, ודא שיש די שטח דיסק פנוי או ברציפות להעביר מערכות הנתונים של OCT לכונן קשיח חיצוני.
4. תיקון תמונה ותצוגה
- פתח את התמונה של מחשב המחברת Jupyter . ipynb (קובץ משלים 1) לדוגמה שעבדה בעיבוד תמונה של OCT (תיקון עיוות, מחסור ברקע, חישוב של מפות העלאה, מיפוי העלאת הגובה).
- במקרה הצורך, חתוך את סריקות OCT כדי שלא לכלול אותות מזויפות ולכוון מחדש את ערכת הנתונים (הביוilm אמור להופיע מעל לשכבה המשנה).
- . נכון לסטייה כדורית זה מתבצע על ידי אלגוריתם תיקון העושה שהוא משתמש השתקפות מאוד התייחסות משטח ידוע להיות שטוח (למשל, התחתון של flume, תת שכבה). ראשית, האלגוריתם מגדיר רשת של 20 × 20 קווים אנכיים מפוזרים באופן קבוע על פני מישור ה-xy של הסריקה OCT. לאחר מכן, הוא בוחר אזור עגול סביב כל נקודה וממוצע עוצמות האות לאורך הפרופיל האנכי (איור 2B). הפרופילים האנכיים מעובדים עם מסנן גאוסיאני שהשתנה:
כאשר x הוא אות הקלט ומσ את סטיית התקן שלו, בעוד ש-C נקבע כגון:
משטח הייחוס מותאם לשפה המקומית כקסימה בכל אחד מהפרופילים האלה. נקודות מיסיועונות מסוננות על בסיס מיקומם של שכניהם בשלושה ממדים (איור 2C). בסופו של דבר, 2הסדר משטח פולינומיאלית המשקף את העיוות שהוצגו על ידי עדשת הסריקה מצויד על פני נקודות אלה (איור 2c). משטח מצויד לאחר מכן משמש להעביר כל פיקסל בכיוון z, ובכך להשיג תמונה שיטוח. יש לכוונן את הפרמטרים של אלגוריתם זה למאפייני סריקת OCT. - נכון לרעשי רקע. זיהוי אזור ריק של התמונה (בדרך כלל מעל הביוilm) והשתמש באלגוריתם התיקון כדי להפחית את עוצמת הרקע הממוצעת מערכי האינטנסיביות של התמונה כדי ליצור תמונת OCT מתוקנת סופית (איור 2D).
- חישוב מפת העלאה מערכת הנתונים של OCT 3D. בשלב זה, הגדר משטח התייחסות של עניין לניסוי הספציפי (לדוגמה, השכבה המשנה) ועוצמת הסף המתאימה. לאחר מכן, השתמש באלגוריתם החישוב של מפת הרמה כדי לחשב את עובי הביוilm עבור כל קואורדינטת (x, y) של המסיכה הבינארית ולהקצותה למטריצה דו-ממדית חדשה (איור 3A). ערכי עובי מוקצים לאחר מכן למטריצה דו-ממדית של גודל התמונה המקורית בכיוונים של x ו-y. תמונה מעובדת שבה העלאת גובה המשטח מדווחת כערך גווני אפור (איור 3B).
- במקרה של מספר סריקות OCT נלקחים בתבנית פסיפס, להגדיר את מספר השורות והעמודות ולתפור את מפות העלאת המתאים. איור 5 מציג דוגמאות של מפות העלאה תפור, כיסוי מגוון רחב של סולמות מרחביים ורזולוציות השגה עם ההתקנה המתוארת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מדגימים את הפונקציונליות של מערכת ההדמיה האוטומטית של OCT באמצעות ניסוי תעלת שנועד לחקור את הphototrophic הרקתית הטמפורלית של ביוגיאמים זרם. הגיאומטריה הצרת בהדרגה של הפלומס המושרה מעברי הזרם במהירות הזרימה לאורך מרכז flumes (ראה התייחסות17). התפתחות הזמן והבידול המבני של הביוilm השתלטו על 18 יום במטרה להבין טוב יותר את ההשפעות של מצבי ההידרודינמיים על ביויוסיס מורפולגנזה. איור 4 מדגים את צמיחת המיקרו-מושבה של הביוilm בעקבות למעלה מ -18 ימי צמיחה. שימוש בערכת הכלים שתוארה לעיל (איור 4A), הינו כימות על פני השטח של המבנה. ביואמצעי האחסון חושב (ראה עבודה באמצעות imageprocessing. ipynb, קובץ משלים 1) עבור חלון נע מרובע עם 3.6 מ"מ אורך קצה (איור 4b) עבור כל מיקום לאורך מהירות הזרימה הדרגתי (איור 4b). הצטברות ביואו, הצטמצמה באופן משמעותי עם הגדלת מהירות הזרימה (המצוינת כמרחק מהחלק הרחב ביותר של הflume; איור 4). חשוב מכך, התקנה ניסיונית זו מאפשרת מדידה רציפה של פרמטרים מבניים (לדוגמה, biovolume, עובי, חספוס) לאורך מדרגות מרחבית גדולות. מכאן, כלי חדש זה מספק את האמצעים כדי לקבל תובנות ליחסים בין מבנה ביוilm ורמזים סביבתיים.
| רכיב תוכנה | תיאור/ |
| stepcraft.py | ספריית פייתון לשליטה במכשיר המיקום. הוא מכיל הגדרות לניווט ולאיתור המכשיר. |
| OctControl. cpp | קוד C++ שנגזר מערכת פיתוח התוכנה (SDK) המופץ עם מערכת OCT. זה צריך להיות מהודר באמצעות ויזואלסטודיו 2017, PythonC/API ו-SDK. |
| ImagesAcquisition.py | ספריית פיתון המכיל את הפקודות לקיחת סריקות OCT במיקומים נבחרים והגדרת תבנית הסריקה האריחים. |
| דפוס התמקדותמוזיציה ipynb | Jupyter המחברת השתמשו כדי לנווט את המכשיר מיקום, לרכוש סריקות OCT עבור רכישת תמונה אוטומטית. |
| OctCorrection.py | ספריית פיתון המגדיר את הפונקציות המשמשות תיקון של תמונות OCT raw וחיסור הרקע. |
| OctProcessing.py | ספריית פיתון המכיל את הפונקציות כדי לחשב ולתפור מפות העלאת. |
| עיבוד מערכות. ipynb | מחברת jupyter כדי להמחיש, נכון ולעבד סריקות OCT. הדבר מכיל גם דוגמה של חישוב biovolume. |
. שולחן 1 רכיבי תוכנה.
| פרמטר | ערך | תיאור/ |
| גנימד | 1, 2, 3 | בחירה של מערכת או גירסה של OCT |
| דיקה | 1, 2 | בחירת עדשת הסריקה |
| נאקנים | 32-900 | מספר הסריקות לסריקת B |
| סריקות הnb | 1-900 | מספר סריקות B |
| סריקות Nc | 128-1024 | מספר פיקסלים לעומק |
| X | 0.1-10 | גודל התמונה בכיוון x-כיוון (mm) |
| Y | 0.1-10 | גודל התמונה בכיוון y (mm) |
| הצעה מחודשת | 1-1.6 | מדד שבירה (1 לאוויר, 1.33 למים) |
| avg_Ascans | 3 | מספר ממוצע הסריקה בממוצע |
| מהירות סריקה | 1, 2, 3 | קצב סריקה (5.5, 15 ו-36 kHz) |
| נתיב | ".. /% Y-% m-% d_% H_% M_% S " | תיקיית יעד עבור סריקות OCT שנרכשו, שימוש בחותמת זמן כמתן שמות |
| גבולות צבע | [0.0-256.0, 0.0-256.0] | גבולות הצבע של הסריקות שנרכשו |
. שולחן 2 הגדרות הפרמטרים של OCT.
איור 1. מבט כולל על רכיבי תוכנה קשיחים ותוכנות. המנועים החורגים של התקן מיצוב GRBL מבוקרת מחוברים מיקרו בקר, מחובר באמצעות USB למחשב בעל לוח יחיד. שרת GRBL מותקן על האחרון, ואת התנועה של התקן המיקום יכול להיות נשלט מכל דפדפן אינטרנט דרך חיבור TCP/IP. לחילופין, הניווט של התקן המיקום ניתן לבצע ממחברת Jupyter פיתון מקודד פייתון (Imagesacquisition וזיציה, קובץ משלים 2) באמצעות ספריית GRBLServer.py. מערכת OCT מחוברת למחשב נפרד ממנה ניתן לבצע רכישת סריקת OCT אוטומטית באמצעות סקריפט פיתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. זרימת עבודה לתיקון סריקת OCT. פאנל A מציג סריקת B-scan לא מעובדת של ביוilm הגדלים על משטח פלקסיגלס שטוח. התמונה מעוותת (עיקול) בגלל הבדלים באורך הנתיב של האור קוהרנטיות נמוכה דרך העדשה. ניתן לתקן עיוות תמונה של OCT על-ידי זיהוי השתקפות חזקה של משטח הפניה שטוח בתמונה. ראשית, 20 × 20 נקודות התייחסות מופצות באופן שווה לאורך כל ערימת התמונות. בכל אחת מנקודות אלה, אות התמונה מממוצע באזור מעגלי (בכיוון x-y) עבור כל עומק (מישור z), קבלת פרופיל עומק בממוצע של עוצמת אות. לאחר מכן, מוחל מסנן גאוסיאני שהשתנה על כל אחד מפרופילי ההפניות 400. לוח ב' מספק דוגמה לאות המקורית לאורך פרופיל העומק המסומן בקו האדום האנכי בלוח A, בפרופיל העומק הממוצע ובאותו פרופיל לאחר החלת מסנן גאוס שהשתנה. מסנן גאוס שהשתנה מאפשר זיהוי של מקסימה מקומית בעוצמת האות, ובכך לזהות את המיקום של משטח התייחסות מאוד משקף. נקודות התייחסות מזוהות כהלכה נבחרות בהתבסס על הקואורדינטות של השכנים שלהם בשלושה מימדים. בדוגמה בלוח C, הנקודות הצהובות נשמרו לתיקון תמונה שלאחר מכן, ואילו הסגולים נזרקו. משטחפולינומיאלי 2 הזמנה הוא לאחר מכן להתאים את נקודות ההתייחסות ממוקם כראוי משמש כדי לתקן את העיוות בתמונה OCT המקורי על ידי העברת פיקסלים בכיוון z. עוצמת הרקע הממוצעת מוערכת מאזור ריק של התמונה ומופחתים מהתמונות המתוקן. פאנל D מציג את אותה סריקה B לאחר תיקון וחיסור הרקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. . מפות הרמה טופולוגיית ביוilm ניתן לדמיין כמו מפות העלאת 2D שבו עובי של ביומסה הוא צבע מקודד. בשביל זה, תמונת OCT תלת-ממדית מthresholded ועובי הביוilm מחושב כמרחק של האות העליון למצע. פאנל A מציג את המסיכה הבינארית של סריקת B-scan שמתקבלת לאחר סף. הקו הכחול מציין את האות העליון בזמן שהקו האדום מציג את משטח ההפניה. האפשרות ' לוח ב' מציגה דוגמה של מפת העלאה שהתקבלה, שינוי קנה הגודל בהתאם לרזולוציית הציר של הבדיקה של OCT. הקו האדום מציין את מיקום ה-B-scan בלוח A.
איור 4. תוצאות מייצגות המציגות את השפעת מהירות הזרימה על גידול ביוilm. למדנו בphototrophic זרם של ביו, מורפוגנזה לאורך הדרגתי במהירות הזרימה באמצעות ניסויי תעלת. מהירות הזרימה גדלה עם המרחק מהפרץ של הפלומי. לאחר 10 ימים של צמיחה, מורפולוגיה של הביוilm התאפיין ב-OCT אוטומטי ברזולוציה שונה וכיסוי קשקשים מרחביים שונים. מפות הרמה (A, B ו-C) מדגימות את המבנה של הביוגים הגדלים תחת מהירות זרימה נמוכה, בינונית וגבוהה, בהתאמה. אלה מפות העלאת מחושבים מ-OCT סריקות עם גודל voxels ב x, y כיוון של 4 μm. שטח הסריקה הוא ריבוע של אורך קצה 3.6 מ"מ. פאנלים D, E ו-F להציג מפות העלאת (נמוך, בינוני ומהירות זרימה גבוהה, בהתאמה) המתקבלים על ידי תפרים 3 × 3 OCT סריקות עם גודל voxel ב-xy-כיוון של 11 μm, שטח הסריקה של 10 מ"מ2 ו חפיפה בין סריקות שכנות של 30%. לוח G מראה מפת העלאת ביוilm הגוברת לאורך כל מהירות המעבר הושגה בניסוי תעלת זה. הוא הושג על ידי תפרים 3 × 51 OCT סריקות עם גודל voxel בכיוון xy של 40 μm, שטח הסריקה של 10 מ"מ2 וחפיפה בין סריקות שכנות של 30%. אזור הסריקה הכולל שהושג הוא 24 × 353 מ"מ. לוח H מדווח על הביוקול בתוך חלון הנע מרובע של 3.6 מ ר. נפח ביולוגי ממוצע ירד באופן משמעותי כפונקציה של מרחק מן הים (I). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. בדיקת דיוק להתקן המיקום. את הדיוק של התקן מיקום הוערך על ידי הרכבה מצלמה 20.2 מאגאפיקסאלס מצויד עדשת מאקרו 35 מ"מ על המכשיר מיקום, ממוקד על סימון צבעוני. התקן המיקום הועבר בכיוון אקראי הרחק מן הסימן ולאחר מכן ממוקם חזרה עבור סך של 80 מחזורים. מיקום הסימן הושווה לאחר מכן. האיור מציג את התזוזה בכיוון x ו-y ביחס לתמונה הראשונה. שים לב כי המשמרת המקסימלית היא כ 16 יקרומטר בכיוון y ואפילו פחות בכיוון x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1. עיבוד imageprocessing ipynb. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2. צילום ממכונות. ipynb לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה של OCT מתאימה היטב לפתרון מבנים בטווח המיקרומטר עם FOV של מספר מילימטרים רבועים. לפיכך, כלי רב-עוצמה עבור מחקר ביוilm10,18. עם זאת, OCT מוגבל כעת לשטח סריקה מירבי של 100-256 מ"מ2, בעוד שתבניות מבניות של ביוilm חורגות לרוב בקנה מידה מרחבי זה19, במיוחד כאשר הבחנה מורפולוגית מונעת על ידי מעברי צבע סביבתיים בקנה מידה גדול 20. מערכת ההדמיה האוטומטית של oct המתוארת בפרוטוקול זה מרחיבה את שטח הפנים המאופיין על ידי OCT עד למספר סנטימטרים רבועים, המאפשרת ביעילות לנטר בידול מורפולוגיים על גבי מגוון מרחבי של קשקשים מרחביים. (בין מילימטרים ספורים למספר סנטימטרים). דיוק מיקום גבוה (בתוך 16 μm; איור 5) מאפשר לנטר במדויק את ההתפתחות המבנית של הביואמים על פני פרקי זמן ארוכים (איור 4), ובכך להגביר את ההזדמנויות להשגת הבנה מכניסטית של הנהגים בעלי ביואילאמים מורפולוגיים . במקביל, השיטה הזאת בשיטת אפיון בלתי-פולשנית ומצמצמת את ההפרעות בצמיחת הביוilm. פתרונות עיבוד התמונה שהוצגו כאן לבנות על מועסקים בעבר ניתוחים של הנתונים ביוilm OCT16, ובכל זאת אוטומציה מספקת כלים במשך זמן רב חסר תקדים ניתוח הנתונים OCT.
מערכת זו התבצעה באמצעות שחקן מיוחד של OCT, כפי שמתואר בפרוטוקול. צעדים קריטיים בפרוטוקול עוסקים בעיקר בהגדרת הרזולוציה של OCT והתמקדות, שהן קריטיות לאיכות תמונה גבוהה. מגבלה של תיקון של שגרת סטיות כדוריות היא שזה תלוי בנוכחות של משטח שטוח רפלקטיבי מאוד. לחילופין, ניתן למדוד משטח תיקון רגיל ולאחר מכן לתקן סריקות OCT. יתרה מכך, התפרים של סריקת OCT תלויים בתכונות מבניות מספיקות כדי ליישר סריקות שכנות. במקרה של הפצה אחידה של ביו, או כיסוי ביוilm נמוך, ניתן להשיג תפרים בהסתמך אך ורק על הדיוק של התקן המיקום. לבסוף, כמו בכל צינור עיבוד תמונה אחר, בעת הגדרת כלים אלה, הוא קריטי כדי להעריך בקפידה את הביצועים של אלגוריתם עיבוד על קבוצה של סריקות מייצגים לפני הטיפול אצוות של תמונות.
הקשיח והתוכנה תוכננו כדי לספק מודולריות מלאים של החלקים הבודדים. באופן ספציפי יותר, מערכת זו ניתן להתאים בקלות כדי לעבוד עם כלים אחרים לאפיון ביואילאמים כגון הדמיה מאקרו צילום באמצעות מצלמות היפרקטרליות או פרופיל microsensor. הצימוד של מידע מבני עם מעברי צבע מותאמים לשפות אחרות במשאבים סביב ובתוך הביואמים יספק תובנות מסוימות ומרכזי לאופן ההתאמה של ביואיאמים למיטוב הקצאת המשאבים. הגמישות מיושמת גם באמצעות שימוש במחברות Jupyter, גישה פתוחה, מהיר ורב תכליתי כלי פיתוח התוכנה.
מגבלה קריטית של הדמיה OCT בכלל נשארת נכות לפתור אובייקטים נעים במהירות. למשל, צליינים להאריך לתוך ולנוע עם הזרם אינם מתוארים במדויק. תחולתה של כלי זה מוגבלת על-ידי מבנים בעלי מבנה קבוע ובלתי מזיזים יחסית. המערכת ממוטבת לעבוד באופן עצמאי, עם זאת, הגדרות ראשוניות ובמידת הצורך, ההתאמה הידנית של מיקוד ותאורה, עדיין נדרשים. הדבר מייצג מגבלה משמעותית אם הדוגמאות שונות משמעותית מתכונות הצפיפות והרפלקטיבית. אוטומציה מלאה, כולל תוכנה מונחה התמקדות והתאמה של תאורה ניתן להשיג עם זאת באמצעות עקרונות דומים (g., מנועי stepper ומתגובות תוכנה-חומרה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
סבסטיאן שייפר מועסק בחברת תורמעבדות Inc.
Acknowledgments
אנו מודים למורסיו אגירי מוראלס. על תרומתו לפיתוח המערכת תמיכה פיננסית הגיעה מקרן המדע הלאומי השוויצרי לT.J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer Verlag. (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
