Burada, non-invaziv ve detay odaklı bir şekilde Drosophila embriyolarında embriyonik kas kasılmaları kaydetmek için bir yöntem sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Eşgüdümlü kas kasılmaları, Drosophila embriyolarında gelişme sırasında erken görülen ritmik davranışların bir biçimidir. Neuronal duyusal geri besleme devreleri bu davranışı kontrol etmek için gereklidir. Kasılmalar ritmik deseni üretmek için başarısızlık nörolojik anomalilerin göstergesi olabilir. Daha önce protein o-mannosylation kusurları, bir posttranslasyonel protein modifikasyon, duyusal nöronların Akon morfolojisi etkileyen ve embriyolar anormal koordine kas kasılmaları sonucu bulundu. Burada, biz protein kas kasılma fenotipi karakterize etmek için kullanılan hatching noktasına kadar geç evre embriyo canlı görüntüleme tarafından peristaltik kas kasılmaları desen kayıt ve analiz için nispeten basit bir yöntem sunuyoruz O-mannosyliltransferase mutantlar. Bu kayıtlardan elde edilen veriler, farklı vücut segmentlerinde kas kasılmasının frekans, yayılma yönü ve bağıl amplitül gibi kas kasılma dalgalarını analiz etmek için kullanılabilir. Biz de vücut duruş incelenmiştir ve doğru embriyo orta çizgi konumunu belirlemek için kaslar özellikle ifade edilen bir floresan işaretçinin avantajlarından alınmıştır. Benzer bir yaklaşım da embriyo haddeleme ve hatching gibi geliştirme sırasında çeşitli davranışları incelemek için kullanılabilir.
Giriş
Peristaltik kas kasılma, insanlar1,2,3yürüyüş ve yüzme benzer bir ritmik motor davranışıdır. Drosophila geç evre embriyolar görülen embryonik kas kasılmaları böyle bir davranış örneği temsil eder. Drosophila çeşitli gelişimsel süreçleri incelemek için mükemmel bir model organizmadır, çünkü Drosophila 'da embriyonik gelişim iyi karakterize edilir, nispeten kısa ve izlenmesi kolay. Bizim yöntemin genel amacı dikkatle kaydetmek ve kasılma ve embriyonik kasların rahatlama dalga boyunu desen analiz etmektir. Biz ayrıntılı bir görselleştirme, kayıt ve ka....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlık
- Bir sıcak 25 G iğne kullanarak bir 100 ml kapasiteli üç köşe plastik kabı yaklaşık 50 delik yaparak bir sinek kafesi hazırlayın ( malzeme tablosunabakın).
- Hazırlama 60 mm x 15 mm Petri yemekleri elma suyu ile-agar (3% Agar ve 30% elma suyu).
- Kuru Maya granül ve su karıştırma taze Maya hamur hazırlayın. Yumurta döşeme artırmak için elma agar plakaları üzerine Maya hamur Spread.
- 50-60 sinekler hakkında anestezi (erkek ve dişi yaklaşık eşit sayıda kullanın) CO2 ve sinek kafesi koyun.
Not: Kadınlarda artan bir oranını kullanarak (kadar ~ 2:1 kadın oranı: erkek) bazı genotyp....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Normal peristaltik kas kasılmaları Film 1' de bir WT (Wild-Type, Canton-S) embriyo gösterilir. Analizimizde kas kasılmaları peristaltik dalgaların ortalama sıklığı saat başına 47 kasılmalar oldu ve ortalama amplitüd WT embriyoları için temel olarak% 60 üzerinde oldu. Embriyo haddeleme film 2 bir WT embriyo için gösterilir, beyaz ok bir trakea ilk pozisyonu ve bir dorsal uzantının konumunu tasvir siyah bir ok işaretleme ile. Dorsal eklentisi (dış) tracheae (iç) yaparken, embriyo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yöntemimiz, dalga periodicity, genlik ve desen gibi peristaltik kas kasılma dalgaları, embriyo haddeleme ve duruş üzerinde dalga etkisi gibi gelişim sırasında önemli embriyo davranışlarını analiz etmek için nicel bir yol sağlar. Bu, embriyonik gelişim sırasında bu ve diğer davranışları düzenleyen belirli genlerin rolünü incelemek için farklı mutantların analizinde yararlı olabilir. Biz kas kasılma genliği, frekans ve embriyoların kasılma dalgası yayılma yönünü analiz etmek için kaslara özgü GFP Marker şiddetinde değişikl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Proje kısmen sağlık hibe RO1 NS099409, NS075534 ve CONACYT 2012-037 (S) VP için ulusal enstitüler tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dijital kamera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | Farklı emisyon filtreleri ile |
| Forseps | FST Dumont | 11254-20 | Uç Boyutları 0,05 mm x 0,01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Mikroskop | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | ile Epifloresan |
| 305767 | 25 G x 1-1 / 2 inç | ||
| Boya Fırçası | Çağdaş el sanatları | Herhangi bir boya fırçası işe yarayacak | |
| Petri kapları | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Yazılım | HCImage Canlı | ||
| İplik Zap Balmumu kalem | Konu Zap II (BeadSmith tarafından)(Amazon) | TZ1300 | Brülör Aleti |
| Üç köşeli plastik beher | VWR | 25384-152 | 100 mL |
Kaynaklar
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator wi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
