Summary
I denne metode beskrives en robust og reproducerbar metode til sammenligning af protein niveauer i forskellige væv og på forskellige udviklingsmæssige timepoints ved hjælp af en standardiseret kvantitative western blotting tilgang.
Abstract
Western blotting er en teknik, der er almindeligt anvendt til at detektere og kvantificere protein udtryk. Gennem årene har denne teknik førte til mange fremskridt inden for både grundforskning og klinisk forskning. Som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er resultatet af vestlige skamplet analyser, let påvirket af valg, der træffes i design og udførelse af forsøget. Specifikke husholdning proteiner har traditionelt været brugt til at normalisere protein niveauer for kvantificering, men disse har en række begrænsninger, og derfor er blevet kritiseret i stigende grad i de sidste par år. Her beskriver vi en detaljeret protokol, som vi har udviklet for at gøre det muligt at foretage komplekse sammenligninger af protein udtryk variation på tværs af forskellige væv, musemodeller (herunder sygdomsmodeller) og udviklingsmæssige timepoints. Ved hjælp af en fluorescerende total protein pletten og indføre brugen af en indre lastning standard, er det muligt at overvinde de nuværende begrænsninger i antallet af prøver, der kan sammenlignes i eksperimenter og systematisk sammenligne protein niveauer på tværs af en række forsøgsbetingelser. Denne tilgang udvider anvendelsen af traditionelle vestlige skamplet teknikker, hvorved forskere at bedre udforske protein udtryk på tværs af forskellige væv og prøver.
Introduction
Western blotting er en teknik, der er almindeligt anvendt til at detektere og kvantificere protein ytringsfrihed, herunder i væv homogeniseret eller ekstrakter. I år, har denne teknik ført til mange fremskridt inden for både grundforskning og klinisk forskning, hvor det kan bruges som et diagnostisk redskab til at identificere tilstedeværelsen af sygdom1,2. Western blotting blev første gang beskrevet i 1979 som en metode til at overføre proteiner fra polyacrylamidgeler nitrocellulose ark og derefter visualisere proteiner ved hjælp af sekundære antistoffer, der var enten radioaktivt mærket eller konjugeret til fluorescein eller peroxidase3. Gennem udviklingen af kommercielt tilgængelige kits og udstyr, er Western blotting metoder blevet stadig mere standardiseret og forenklet gennem årene. Ja, teknikken er nu let udført af forskere med forskellige baggrunde og niveauer af erfaring. Som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er resultatet af vestlige skamplet analyser, let påvirket af valg, der træffes i design og udførelse af forsøget. Det er derfor vigtigt, at adgangen til standardiseret Western blotting metoder ikke tilsløre behovet for omhyggelig eksperimentelle planlægning og design. Eksperimentelle overvejelser omfatter, men er ikke begrænset til, eksempeldatabase forberedelse og håndtering, udvælgelse og validering af antistoffer til registrering af protein og gel til membran overførsel effektivitet af især små eller store (< 10 eller > 140 kDa) proteiner4,5,6,7,8,9. Protein kvalitet af den oprindelige prøve spiller en væsentlig rolle ved fastsættelsen af resultatet af den efterfølgende Western blot analyse. Som protein kan udvindes fra en bred vifte af prøver og kilder, herunder cellelinjer, væv fra dyremodeller og post mortem humane væv, er konsistens i håndtering og forarbejdning forpligtet til at opnå reproducerbare resultater. For eksempel, når langtidsopbevaring af prøver til protein udvinding er påkrævet, er det vigtigt at indse, at selv om protein er generelt stabilt på-80 ° C, forskelle i protein stabilitet mellem udvundne proteiner og intakt væv ved-80 ° C har været rapporterede10. Desuden, for at opnå reproducerbare estimater af protein mængder, konsekvent homogenisering af prøver er afgørende. Optimering af forskellige lysis buffere og homogenisering metoder (f.eks. manuel homogenisering sammenlignet med automatiserede metoder) kan være nødvendig før du starter en storstilet kvantitative eksperiment.
Normalisering strategier til at korrigere for protein lastning og kvantificering variation er afgørende for at opnå robuste, kvantitative resultater af protein udtryk. Husholdning proteiner som β-actin, har α-tubulin, β-tubulin og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) traditionelt været brugt til at normalisere protein niveauer for kvantificering. Normalisering til specifikke husholdning proteiner til kvantificering formål er imidlertid blevet kritiseret i stigende grad over de sidste par år11,12. For eksempel kan udtryk for husholdning proteiner ændre på tværs af forskellige udviklingsstadier13,14, på tværs af væv fra de samme dyr4, og under forskellige sygdom betingelser4,15 ,16,17. Derfor begrænser brugen af specifikke husholdning proteiner mulighederne for at foretage mere komplekse sammenligninger mellem protein udtryk fra forskellige væv, på forskellige timepoints og under forskellige forsøgsbetingelser. Et alternativ til husholdning proteiner til kontrol for protein lastning variation er brugen af en total protein pletten (TPS) at etiketter og visualiserer alle proteiner til stede i en prøve. TPS giver signal normalisering baseret på total protein belastning i stedet niveauer af et specifikt protein og derfor kvantificering af TPS signal bør være sammenlignelige og reproducerbare uanset eksperimentelle tilstand, prøvetype eller udviklingsmæssige tidspunkt . Ponceau S, plet-fri geler, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black og Cy5 (gennemgik i ref. 18) er eksempler på total protein pletter. Hver af disse metoder har specifikke fordele og begrænsninger og valg af metode afhænger af tiden og værktøjer til rådighed samt eksperimentelle setup4,18.
Ud over at bruge en TPS for at korrigere for inden for membran lastning og kvantificering variabilitet, kan det være nødvendigt at sammenligne prøver mellem forskellige membraner, navnlig når du udfører omfattende protein udtryk analyse. Dog kan variabilitet i faktorer som antistof bindende effektivitet og total protein pletten intensitet indføre yderligere variabiliteten mellem protein prøver, der analyseres på separate geler og membraner. For robuste kvantificering i denne situation er det derfor nødvendigt at indføre en yderligere normalisering skridt at tage højde for mellem membran variabilitet. Dette kan opnås ved at inkludere en indre lastning standard på hver af separat analyseret membraner, der holdes konstant på tværs af eksperimenter. Denne standard kan tage form af et protein lysate, der kan fås i tilstrækkelige mængder til at bruges på tværs af alle membraner inkluderes i eksperimentet. Her bruger vi en lysate af mus hjernen (fremstillet af 5 dage gamle kontrol mus), som hjernen er let homogeniseret og opnåede proteinet lysate indeholder en betydelig mængde af protein i høj koncentration. Indlæsning af en intern standard i tre eksemplarer giver prøver på separate membraner til at blive normaliseret og sammenlignes direkte.
Her beskriver vi en detaljeret protokol, som vi har udviklet for at gøre det muligt at foretage komplekse sammenligninger af protein udtryk variation på tværs af forskellige væv, musemodeller (herunder sygdomsmodeller) og udviklingsmæssige timepoints19. Ved at kombinere en fluorescerende TPS med brug af en indre lastning standard, var vi i stand til at overvinde de nuværende begrænsninger i antallet af prøver og forsøgsbetingelser, som kan sammenlignes i et enkelt eksperiment. Denne tilgang udvider anvendelsen af traditionelle vestlige skamplet teknikker, hvorved forskere at bedre udforske protein udtryk på tværs af forskellige væv og prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Væv for at denne procedure blev der indsamlet fra dyreforsøg, som blev godkendt af den interne etiske komité på universitetet i Edinburgh og blev udført i overensstemmelse med institutionelle og britiske Home Office forordninger under myndighed af relevante personlige og projekt licenser.
Bemærk: Denne protokol er blevet optimeret ved hjælp af standardiserede, kommercielt tilgængelige kits og reagenser for at øge reproducerbarhed (Se Tabel af materialer).
1. forberedelse af prøver
-
Protein udvinding
- Overførsel snap-frosne celle eller vævsprøver fra-80 ° C på tøris, tø på isen, og vask efter behov med is koldt 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (for detaljer om væv og PBS vasker, se tabel 1). Undgå unødvendige fryse-tø cykler, da dette vil påvirke protein kvalitet.
- Tilføj radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natrium deoxycholate, 0,1% SDS) indeholdende 1 x protease hæmmer til hver prøve, ved hjælp af den optimale mængde pr. væv vægt (Se tabel 1 for anbefalinger).
Bemærk: Afhængigt af programmet, type og mængde af homogenisering buffer muligvis yderligere optimering. - Bruge en håndholdt elektrisk homogeniseringsapparat med en polypropylen pistil for at homogenisere vævsprøver. Mellem hver prøve, vask pistil i dobbeltdestilleret vand og tør med en ren væv. Ændre pistil mellem forskellige eksperimentelle betingelser og væv.
- Forlade prøverne i isbad i 10 min efter homogenisering. Centrifugeres prøver på > 10.000 x g ved 4 ° C i 10 min.
- Overføre supernatanten til en ny tube på isen uden at forstyrre pelleten. Supernatanten er eksemplet protein. Gemme den udpakkede protein ved-80 ° C eller direkte videre til måling af proteinkoncentration.
-
Kvantificering og normalisering af proteinkoncentration
- Måle proteinkoncentration ved hjælp af en bicinchoninic syre (BCA) assay. Forberede en BCA assay mix ifølge producentens anvisninger i en 96-brønd optisk plade ved hjælp af 200 µL af BCA mix pr. brønd.
Bemærk: Andre kvantificering metoder såsom Lowry og Bradford assays kan også bruges til at bestemme proteinkoncentration så længe proteinkoncentration er kvantificeret konsekvent på tværs af eksperimenter. - Forberede bovint serumalbumin (BSA) standarder på stigende koncentrationer i tre eksemplarer og tilføje 1 µL af hver prøve, protein i to eksemplarer. Inkuber 96-brønd plade i en forvarmet varme blok ved 60 ° C i 10 minutter eller længere, hvis proteinkoncentration forventes at være lav.
- Efter inkubationen måle absorption på 560 nm med en pladelæseren.
- Eksportere plade læser målinger og beregne proteinkoncentration ved at sammenligne de gennemsnitlige absorbans værdier af hver prøve til en standardkurve, der er fremstillet ved hjælp af protein-standard. Den R-kvadrerede værdi til standardkurven skal være større end eller lig med 0,98 præcist vurdere prøve proteinkoncentration.
- Normalisere mængden af protein ved at forberede fortyndinger af protein prøver i prøvebuffer og ultrarent vand. Den samlede mængde kan justeres afhængigt af gel anvendes. Lastning 30 µg af protein pr. vognbane som et startbeløb anbefales. Tilføje reduktionsmiddel såsom dithiothreitol (DTT; slutkoncentration 5 mM) eller beta-mercaptoethanol (slutkoncentration 200 mM) til hver prøve som krævet. Der afpipetteres ufortyndet beta-mercaptoethanol i et stinkskab.
- Inkuber prøver i en varme blok ved 70 ° C i 10 min. sætte prøver på is, vortex og spin-ned kort for at indsamle. Holde på is indtil indlæsning af gelen.
- Måle proteinkoncentration ved hjælp af en bicinchoninic syre (BCA) assay. Forberede en BCA assay mix ifølge producentens anvisninger i en 96-brønd optisk plade ved hjælp af 200 µL af BCA mix pr. brønd.
2. gel elektroforese af proteiner prøver
-
Enhed og gel oprettet
- Opsætning af en præfabrikerede 4 – 12% Bis-Tris gradient gel (Se Tabel af materialer) i gel elektroforese kammer system. Skyl geler med dobbeltdestilleret vand før brug.
Bemærk: Afhængigt af størrelse, interaktioner og overflod af protein af interesse, geler med et andet forløb, buffering agent eller godt størrelse og antal kan bruges. - Der tilsættes 500 mL af 1 x MES SDS kører buffer fortyndet i dobbeltdestilleret vand pr. tank. Fjern forsigtigt kammen fra geler efter tilføjer den buffer, der kører uden at forstyrre brønde i stabling gel.
- Opsætning af en præfabrikerede 4 – 12% Bis-Tris gradient gel (Se Tabel af materialer) i gel elektroforese kammer system. Skyl geler med dobbeltdestilleret vand før brug.
-
Protein lastning
- Indlæse 3,5 µL af en standard protein i brønden. Afhængigt af layoutet prøve kan lastning en protein stige på begge sider af gel støtte i mere præcist estimering protein størrelse. Brug fine spids gel lastning tips til mere præcise prøve lastning.
- Når du bruger en intern standard til mellem membran normalisering (Se trin 5 nedenfor og diskussion), indlæse et beløb, der svarer til de andre prøver i de første 3 brønd ved siden af protein stigen.
- Indlæse 30 µg af hver prøve i de resterende brønde. Tilføj 1 x prøvebuffer alle tomme brønde.
-
Elektroforese
- Samle gel tank efter indlæsning af prøverne. Køre prøverne gennem stabling gelen på 80 V i 10 min efterfulgt af 150 V for en yderligere 45-60 min.
3. protein overførsel
Bemærk: Protein overførsel i denne protokol udføres ved hjælp af en kommercielt tilgængelig halvtør blotting system (Se Tabel af materialer) for hurtig og sammenhængende resultater.
- Forberede protein overførsel af pre iblødsætning filterpapir i dobbeltdestilleret vand og sikre gel kniv, plast Pasteur pipette, blotting roller og pincet er klar til brug.
- Åbn overførslen stakken ved omhyggeligt at fjerne alle indpakning folier. Fjerne toppen fra bunden stakken og sæt den til side. Hurtigt fugte membran i bunden stakken med flere dråber af elektroforese kører buffer (2-3 mL). Når overførslen stakken er åben, er det vigtigt at forhindre PVDF membran mod udtørring.
- Efter at have stoppet elektroforese, åbne den færdigstøbte gel ved hjælp af gel kniv og afskære de stabling gel. Skære gel omkring kanterne til at frigøre det fra plast støbt. Holde gel kniven våde for at undgå skader på gelen.
- Samle overførsel stak fra bund til top: bund stack (indeholdende PVDF membran), protein gel, filtrerpapir. Bruge blotting rullen til at fjerne alle luftbobler. Placer den øverste stak oven på filtrerpapir og roll stakken igen for at fjerne luftbobler. Skub ikke alt for stærkt, da dette kan forårsage gel til at deformere under protein transfer.
- Overføre hele stakken i overførsel enheden med elektroden på venstre side af enheden og placere gel svamp på toppen af stakken, så det er afstemt med de tilsvarende elektriske kontakter på enheden. Luk låget, vælge og starte det korrekte program (20 V i 7 min er en anbefalede udgangspunkt).
- Når du er færdig, forlade låget lukket for 2 min til at tillade stakken til at køle ned og forhindrer membranen i at tørre. Fjern overførsel stakken og skære membranen til gel størrelse. Vask cut membranen hurtigt med dobbeltdestilleret vand før du fortsætter med total protein pletten.
4. total protein farvning
Bemærk: Brug af fluorescerende påvisning giver en betydelig fordel over mere traditionelle tilgange (fx ECL detection), som den lineære område og følsomheden kan være meget bedre kontrolleret4. Derfor, i trin 4 og 5, der anvendes en fluorescerende TPS og fluorescerende sekundære antistoffer (Se Tabel af materialer).
- Rulle membranen i en 50 mL tube med protein side vender indad. På grund af lysfølsomhed fluorescerende TPS og sekundære antistoffer udføres alle efterfølgende trin i mørke.
- Der tilsættes 5 mL af protein pletten løsning (Se Tabel af materialer) og Ruger på en valse i 5 min ved stuetemperatur. Fordi TPS og vaskebuffer indeholde methanol, bære disse trin ud i et stinkskab.
- Kassér Farvningsopløsningen og vaskes to gange hurtigt med 5 mL vaskeopløsning (6,3% eddikesyre i 30% methanol). Sted rør kort tilbage på rullen mellem vask trin. Skyl membran kort med ultrarent vand før du fortsætter.
5. blokering, antistof inkubation og påvisning
- Blokering membranen: Tilføj 3 mL blokerende buffer (Se Tabel af materialer) til 50 mL tube indeholdende membranen. Inkuber membran på en valse i 30 min. ved stuetemperatur. Afhængig af valg af antistof, kan type blokerende buffer anvendes kræver optimering.
-
Primære antistof inkubation
- Fjern blokering buffer og erstatte med den primære antistof på den passende, optimeret koncentrationen (figur 1 og figur 2: mus-anti-SMN på 1:1, 000, fortyndet i blokerende buffer).
Bemærk: Tilstrækkelig optimering af primære antistoffer bør omfatte en bekraeftelse at antistoffet registrerer et protein produkt af den rigtige størrelse, mens viser ingen eller minimal binding til andre, uspecifik proteinprodukter. Hvis det er muligt, afprøve og sammenligne flere antistoffer mod proteinet af interesse. - Inkuber membran på en rulle natten over ved 4 ° C. Den næste dag, fjerne antistof løsning og vaske 6 gange i 5 min. med 1 x PBS på en rulle ved stuetemperatur (RT).
- Fjern blokering buffer og erstatte med den primære antistof på den passende, optimeret koncentrationen (figur 1 og figur 2: mus-anti-SMN på 1:1, 000, fortyndet i blokerende buffer).
-
Sekundær antistof inkubation
- Forberede den specifikke sekundær antistof på 1:5,000 mod vært for det primære antistof i 5 mL blokerende buffer. Andre sekundære antistoffer kan kræve andre fortyndinger eller brug af alternative blokerende buffere.
- Inkuber membran med sekundær antistof løsning på en valse i 1 time på RT. Efter inkubationen vaske membran tre gange 30 min med 1 x PBS på en rulle.
- Tør membranen og holde membranen beskyttet mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie indtil påvisning. Membraner kan opbevares ved 4 ° C for langtidsopbevaring.
-
Billede erhvervelse
- Login hen til den computer tilsluttet scanneren. Placer membranen på scanneren med protein side vender nedad og vælg scanningsområdet i softwaren.
- Optimere laser intensitet for begge (700 nm og 800 nm) kanaler, ved at bekræfte ingen mætning opstår. Erhverve billeder i begge kanaler og eksportere billeder til videre analyse (trin 6).
6. Western blot analyse og kvantificering
Bemærk: Disse anbefalinger er baseret på den frit tilgængelige billede Studio software. Dog sammenlignelige analyser kan også gøres ved hjælp af andre software-pakker, såsom ImageJ.
- Importer filen: oprette en lokal arbejdsområde på computeren, der bruges til analyse. Dette skaber en database over billedfiler til erhvervede western blotting. Importere filer opnået på scanneren og Vælg billede til analyse.
-
TPS analyse
- Display 700 nm kanal til at vise den samlede protein farvning resultat. Et eksempel på en TPS billedet indgår i figur 1 i hvilke forskellige væv fra neonatal (P5) (fig. 1A-B) og 10 - uge gamle mus (Figur 1 C-D) sammenlignes direkte. Tilsvarende viser figur 2 et eksempel på en direkte sammenligning af hjernevæv fra mus i forskellige aldre.
- Vælg analyse under fanen i øverste højre hjørne og vælg Tilføj rektangel til at definere området af interesse for normalisering (figur 1B, D). Kopier og Indsæt den første rektangel område på hver individuel prøve at sikre, at den definerede region er på samme størrelse til alle analyserede baner.
- Kopier resultatet fra fanen figurer i nederste venstre hjørne af softwaren.
-
Kvantificering
Bemærk: Den optimale metode til kvantificering af prøver afhænger den eksperimentelle design. Vi vil her give et illustrerende eksempel på påvisning af overlevelse motor neuron protein (Smn; en vigtig protein involveret i neuromuskulær sygdom spinal muskelatrofi20,21), der er kendt for at falde over tid 19 og hvordan normalisering af Smn signal intensitet til TPS giver pålidelige estimater af protein udtryk udvikling.- Figur 2 viser et fald på Smn udtryk med stigende alder af dyr med TPS som protein lastning kontrol. Gentag trin 6.2.1-6.2.3 for at kvantificere protein indlæsning (figur 2B). Gentag trin 6.2.1-6.2.3 i den 800 nm kanal (figur 2A) til at analysere protein af interesse.
- Kopier resultaterne fra både TPS og protein af interesse til et regnearksprogram. På regnearket først normalisere protein indlæsning ved at bestemme de højeste TPS signal og dividere hver TPS signal værdi af denne værdi til at opnå den normaliserede protein lastning værdi.
- Opdele de 800 nm signalværdi fra hver individuel prøve af dens tilsvarende normaliseret protein værdi til at beregne relative protein udtryk forholdet i forskellige prøver.
- Efter den første normalisering, sammenligne forskellige tidspunkter eller væv til den gennemsnitlige værdi af den interne standard kan foretage direkte sammenligninger på tværs af forskellige membraner og eksperimenter.
7. statistik
- For at bestemme eventuelle statistisk signifikante forskelle i protein udtryk på tværs af komplekse og store grupper af prøver, kræves passende statistiske metoder. Selv om en detaljeret diskussion af statistiske baggrund går for denne hvidbogs anvendelsesområde, vil vi fremhæve flere overvejelser og detaljeret en succesfuld tilgang, at vi tidligere har brugt19.
- Som for mange eksperimenter repræsenterer protein kvantificering målinger ikke helt uafhængige data. Her, for eksempel er flere væv generelt fremstillet af enkelt dyr til at bestemme protein niveauer på tværs af flere organer for en enkelt eksperimentelle tidspunkt. Derfor brugte vi en blandet effekter modeller til at analysere forskellene i protein udtryk over tid og mellem væv. Generelt giver blandede effekter modeller et effektivt middel til at håndtere ikke-uafhængighed og dermed undgå pseudo replikering22,23. I det foreliggende tilfælde øge blandet effekter modeller statistiske effekt af regnskab for gentagne målinger blandt væv inden for enkeltpersoner. Vi bruge den statistiske programpakke R til at udføre disse analyser, som er frit tilgængelige og alsidig. Dog kan andre kommercielt tilgængelige pakker kunne udføre lignende analyser.
- Den nuværende eksperimentelle design indebærer en "split plot" design fordi hver mus tilhørte kun én aldersgruppe. Derfor, vi modelleret individuelle mus (mus ID) som en tilfældig effekt med et entydigt id; Vi har også tegnede sig for væv, alder og deres interaktion som fast effekter. Vi modelleret data ved hjælp af funktionen lmer i biblioteket Rasmussen, lme4. Som en kvalitetskontrol skridt, vi visualiseret residualer at vurdere antagelser med ens varians og normal fordeling og forvandlet data, hvor det er nødvendigt for at opfylde disse forudsætninger. For at teste for en betydelig interaktion mellem væv og alder, passer vi en identisk model, der manglede denne interaktion, og sammenlignet med de modeller, ved hjælp af parametrisk bootstrapping (R funktionen PBmodcomp i biblioteket, pbkrtest). Hvor betydningsfulde vekselvirkninger opstod, brugte vi funktion emmeans (i biblioteket emmeans R) til at fastslå årsagen til interaktionen. For eksempel, sammenlignede vi gennemsnitlige udtryk blandt aldersklasser inden for hver væv; en betydelig interaktion kan opstå mellem alder og væv, hvis sige, to givne aldersklasser afveg betydeligt for en væv, men ikke en anden. I Resumé giver disse tilgange en måde at udvide robustheden af konklusionerne fra vestlige skamplet eksperimenter ved at yde statistisk støtte til disse resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi medtager eksempler på brugen af TPS og en intern standard til lette sammenligninger af protein niveauer på tværs af væv og tidspunkter. Figur 1 viser resultater fra Western blotting på protein udvundet af væv fra neonatal (postnatal dag 5) i forhold til voksne mus (10 - gamle uge). TPS og Smn immunblot er vist i figur 1A, C. Kvantificering af fluorescens intensiteten af TPS blev opnået ved måling af fluorescens-intensiteten inde i boksen rektangel på hver lane og dens resultater er vist i tabellerne i figur 1B og 1 D. Bemærk at prøver fra forskellige væv er karakteriseret ved forskellige TPS protein band mønstre og det er derfor nødvendigt at bruge hele banen til normalisering formål. Faktisk, når hele baner er analyseret, fluorescens-intensiteten forbliver relativt lignende eksempler, der viser TPS for normalisering er velegnet til dette formål. En intern standard bestående af en P5 hjernen lysate blanding blev også medtaget for at illustrere, hvordan det kan bruges til yderligere sammenligninger mellem forskellige membraner. Desuden, i figur 2viser vi, hvordan en fluorescerende TPS kan bruges til at sammenligne protein niveauer på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter. Her viser vi Smn niveauer i hjernen lysates fra neonatal (P5), fravænning alder (P20) og voksen (10W) mus (figur 2A). Selvom Smn niveauer klart falde med alderen, forbliver TPS kvantificering konstant, som illustreret i figur 2B.
Figur 1. Western blotting viser TPS og Smn protein niveauer i mus væv på to forskellige alderstrin. TPS og Smn protein til P5 (A) og 10 uger gamle (C) mus. (B, D) Fluorescens-intensiteten af hele-lane TPS blev beregnet og er angivet (i arbitrære enheder). M: markør/protein standard; kDa: kilodalton; a.u.: vilkårlig enhed; P5: postnatal dag 5; 10W: 10 uger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Analyse af Smn udtryk i mus væv på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter. (A) hjerne lysates fra væv fremstillet af P5, P20 og 10 uger gamle mus blev analyseret ved hjælp af TPS (toppanelet) og SMN (nederste panel). (B) Fluorescens-intensiteten af TPS blev beregnes og angives i arbitrære enheder. M: markør/protein standard; kDa: kilodalton; a.u.: vilkårlig enhed; P5: postnatal dag 5; P20: postnatal dag 20; 10W: 10 uger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Væv | Ca. vægt * | 1xPBS wash (4 ° C) | Gentag vask | Homogenisering buffer ** |
| Rygmarven | 40 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Muskel (GC) | 20 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Hjernen | 240 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Hjerte | 60 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| Leveren | 130 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Nyre | 45 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| * Disse vægte er vejledende værdier for væv fremstillet af P8 mus. | ||||
| ** Disse mængder er indikationer og kan tilpasses yderligere vægt af væv. | ||||
Tabel 1. Oversigt over forventede væv vægte og tilsvarende anbefalinger til PBS vasker og lysis buffer volumen skal bruges til homogenisering. Vægtene er indikationer for væv fremstillet af postnatal dag 8 (P8) mus. PBS og lysis buffer diskenheder kan skaleres op og ned efter eksperimentel behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med de relevante eksperimentelle design, kontrolforanstaltninger og statistiske analyser, kan western blotting bruges til at foretage pålidelige kvantitative estimater af protein udtryk inden for og mellem et varieret udvalg af biologiske prøver. Den protokol, vi beskriver i det aktuelle manuskript har til formål at tjene som retningslinje for forskere søger for at bruge Western blotting for at foretage kvantitative analyse på tværs af større og mere komplekse grupper af prøver ved hjælp af en kombination af fluorescens-baseret metoder til påvisning, total protein lastning normalisering og interne standarder. Selv om fokus her er på bestemmelse og sammenligne protein udtryk fra forskellige mus væv og på forskellige alderstrin, kan denne tilgang også udvides til at sammenligne protein udtryk i andre eksperimentelle betingelser.
Et centralt skridt i vores nuværende protokol er en normalisering af proteiner af interesse for total protein indlæst af kvantificere en fluorescerende total protein pletten. TPS normalisering korrigerer for variation i stikprøven lastning og fejlmarginer i protein kvantificering metoder. Men, fordi antallet af protein prøver, der kan analyseres på en enkelt membran er ofte begrænset, yderligere normalisering kan være nødvendigt at sammenligne flere membraner. Faktisk kan variation mellem hvordan proteiner er fundet på forskellige membraner (på grund af for eksempel antistof inkubation tid eller temperatur variation) forårsage variation ud over der blev indført ved lastning og kvantificering trin i protokollen. Her bruger vi en intern standard, der består af en enkelt protein lysate mix, der er indlæst i tre eksemplarer på hver gel og giver mulighed for sammenligning og normalisering mellem geler/membraner. Teoretisk vil kunne dette enhver proeve, protein, så længe det kan gøres i tilstrækkelige mængder, således at samme prøve kan bruges til alle eksperimenter. I vores forsøg og, bruger vi en blanding af hjerne protein lysates, som hjernen homogeniseret indeholder store mængder af protein og fås typisk med en høj koncentration. Gennemsnit kvantificering af tredobbelt standard bør yderligere øge nøjagtigheden af kvantificeringer på tværs af membraner og bidrage til reproducerbarhed af eksperimentet.
Protein niveauer kan bestemmes af en række forskellige teknikker og den foretrukne metode afhænger prøvetypen ved at blive analyseret og målet med forsøget. Reproducerbare kvantificering af Western skamplet fungerer bedst i situationer, hvor eksperimentelle betingelser kan være velkontrollerede, når ved hjælp af musen eller andre animalske modeller af en defineret genetiske baggrund. Derimod i mange eksperimenter ved hjælp af menneskelige patientprøver, dette kan være mindre gennemførlige som alder, genetisk variation og væv prøvetidspunkter er meget sværere at styre end i (dyremodel) systemer. Plade-baserede teknikker såsom ELISA kan være mere egnet til disse analyser, selv om den forsigtige validering af antistof specificitet er afgørende. For eksempel i skrøbelige X syndrom forskning, antistoffer har vist sig at opdage forskellige isoformer og når de anvendes i ELISA dette ville føre til overvurdering af den samlede mængde af protein som ELISA bestemmer et signal til alle isoformer kombineret24. Optimale muligheder for metoder til at bestemme protein udtryk er derfor prøve afhængig af kontekst, type og de forskningsspørgsmål, der er ved at blive undersøgt.
Udfører passende statistisk analyse er en forudsætning for pålideligheden af nogen konklusioner fra kvantificering af biologiske data. Statistisk analysere komplekse data, som genereres ved at sammenligne forskellige væv, tid peger eller øvrige eksperimentelle betingelser og kombinationer heraf kan kræve mere avancerede statistiske modeller end ANAVA med post-hoc test kan levere. For mere komplekse statistiske modeller, såsom de blandede effekter model tilgang, vi beskriver i det aktuelle manuskript, kan det være tilrådeligt at søge yderligere råd fra biostatisticians. Tilstrækkelig statistisk analyse af store protein udtryk kan forbedre robustheden af resultaterne og pålidelighed og reproducerbarhed af resultaterne.
I sammendrag giver den eksperimentelle tilgang vi beskrive her en robust og reproducerbar metode for forskere, der ønsker at bestemme protein udtryk ved hjælp af vestlige skamplet i komplekse prøver giver mulighed for at besvare forskningsspørgsmål, nye og spændende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at videregive.
Acknowledgments
E.J.N.G. understøttes af Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Andre midler er blevet leveret af SMA Trust (SMA UK konsortium; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), universitetet i Edinburgh DTP i præcision medicin (T.H.G., ll & A.M.M.) og Euan MacDonald Forskningscenter for Motor neuronsygdomme sygdom (T.H.G).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
