Summary
このプロトコルは、脳内のAAVベースのウイルスシステムとFLEXシナプシン駆動GFPレポーターを使用して、生体内で直接再プログラムされたインターニューロンを生成することを目的としており、生体内での細胞同定とさらなる分析を可能にします。
Abstract
脳内の常駐グリアを生体内の機能的およびサブタイプ特異的ニューロンに変換することは、代替細胞置換療法の開発に向けた一歩を踏み出す一方で、その場で細胞の運命を研究するツールを作成します。これまで、生体内リプログラミングを介してニューロンを得ることは可能でしたが、これらのニューロンの正確な表現型や成熟した方法は詳細には分析されていません。このプロトコルでは、AAVベースのウイルスベクターシステムを用いて、生体内再プログラムされたニューロンのより効率的な変換および細胞特異的同定について説明する。また、再プログラムされた細胞の神経成熟の機能評価のためのプロトコルも提供する。フリップ切除(FLEX)ベクターを注入することにより、リプログラミングおよびシナプシン駆動レポーター遺伝子を、細胞リプログラミングの標的となる脳内の特定の細胞型に含む。この技術は、新たに再プログラムされたニューロンを容易に同定することを可能にする。結果は、得られた再プログラムされたニューロンが時間の経過とともに機能的に成熟し、シナプス接触を受け取り、異なるタイプのインターニューロンの電気生理学的特性を示す。転写因子Ascl1、Lmx1aおよびNurr1を使用して、再プログラムされた細胞の大半は、高速スパイク、パルブアルブミン含有インターニューロンの特性を有する。
Introduction
この方法の全体的な目標は、生体内の脳常駐グリアを、パルブアルブミン発現インターニューロンなどの機能的およびサブタイプ特異的ニューロンに効率的に変換することです。これは外因性細胞源を必要とせずに脳疾患に対する代替細胞補充療法の開発に向けた一歩を提供する。また、その場でセルの運命スイッチを研究するためのツールを作成します。
脳は新しいニューロンを生成するための限られた能力を持っています。.したがって、神経疾患においては、脳修復のための外因性細胞源の必要性がある。このために、細胞の異なる供給源は、原発組織、幹細胞由来細胞および再プログラムされた細胞1、2、3からの細胞を含む、長年にわたって激しい研究を受けてきた。常駐脳細胞をニューロンに直接リプログラミングすることは、患者自身の細胞を使用して脳内に新しいニューロンを生成するため、脳修復のための魅力的な方法を提供できる最近のアプローチです。現在までに、脳4、5、6、7 8、9などの異なる脳領域におけるウイルスベクター配信を通じた生体内リプログラミングに複数の報告が示されている。皮質、脊髄、線条体および中脳5、10、11、ならびに無傷および病変性脳5、8、11、12。阻害性ニューロンと興奮性ニューロンの両方が得られている 4,8,しかし、これらの細胞の正確な表現型または機能性はまだ詳細に分析されていません。
このプロトコルでは、生体内再プログラムされたニューロンのより効率的なリプログラミングと細胞特異的同定について述べている。機能性および免疫組織化学的形質に基づく神経成熟および表現型特性の機能評価のためのプロトコルを提供する。
我々は、誘導性AAVベクターとGFPレポーターを用いて、生体内で再プログラムされたニューロンを同定した。ウイルスベクターのこの選択は、脳の分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染するという利点があり、標的細胞の数を増加させ、レトロウイルス7、8の使用に代わるものとして。ニューロン特異的なシナプシン駆動FLEXレポーター(GFP)により、新たに生成されたニューロンを特異的に検出することが可能になりました。これまでの研究では、生体内リプログラミング7、9にサブタイプ特異的プロモーターを使用しており、特定の細胞型におけるリプログラミング遺伝子およびレポーターの発現も可能にしている。しかし、この方法では、レポーターとニューロンマーカーの共発現の死後分析により、再プログラムされたニューロンのさらなる同定が必要である。本明細書に記載されているようなニューロン特異的レポーターの使用は、直接的な同定を可能にする。これは成功した転換の直接証拠を提供し、パッチクランプ電気生理学に必要な生きている細胞の同一証明を可能にする。
Protocol
すべての実験手順は、欧州連合指令(2010/63/EU)の下で実施され、ルンド大学とスウェーデン農業省(Jordbruksverket)の実験動物の使用のための倫理委員会によって承認されました。マウスは、食物と水へのアドリビタムアクセスを伴う12時間の光/暗いサイクルに収容される。
1. ウイルスベクター
- AAVベクトルのクローン作成
- Cre-誘導性AAV5ベクターを作成するには、GFP、Ascl1、Lmx1aおよびNR4A2(Nurr1)のcDNAを逆方向に挿入し、逆方向の2組の逆方向に、逆並型の反並列LoxPフリップ切除(FLEX)配列(材料の表)を挿入する。cDNA挿入には、pAAV-Cba-FLEXのようなバックボーンまたはFLEX配列とチキンベータアクチン(CBA)プロモーターを含む同様の構造を持つバックボーンを使用します。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および制限酵素により、各単一cDNA(例えば、Ascl1)をバックボーンに挿入する。シナプシンプロモーターおよびAscl1、Lmx1a、Nurr1の制御下でシナプシンプロモーターの制御下でGFPを発現し、ユビキタスに発現したCBAプロモーターの制御下で。
注:特定のエンドトキシンフリープラスミドDNA分離キットを使用してエンドトキシンフリーDNAを持っていることを確認してください。 - クローン作成ステップの成功を確認するために、使用前にコンストラクトのシーケンスおよび制限分析を実行します。
- AAV5ウイルスベクター産生
注意:アデノ関連ウイルス(AAV)を取り扱う場合は、現地のバイオセーフティガイドラインを参照してください。スウェーデンでは、このプロトコルで使用されるAAVはバイオセーフティレベル2(BSL-2)を必要とします。- 標準的な培養培地を持つ種子HEK293T細胞(DMEM+Glutamax+10%FBS+ペニシリン(100 Μg/mL)ストレプトマイシン(100 μg/mL)、T175フラスコの3 x 106細胞フラスコの密度で参照してください。AAV のバッチごとに 5 フラスコを考慮し、一度に 6 つのバッチを計画します。
- 細胞が50〜70%の合流に達したら、トランスフェクションのために以下の混合物を調製する(175 cm2フラスコ当たり)。
- 50 mL遠心管で、ベクタープラスミドおよびpDGシリーズヘルパープラスミド(pDP5、pDP6)の等化量を加え、175 cm2フラスコ当たり72 μgの合計量を加えます。
- トリス-EDTA バッファ(TE バッファー、10 mM トリス-HCl、1 mM EDTA)を 144 mL の最終容積に追加します。
- 総容積が1296 mLになるように超純水を加え、混ぜます。
- 2.5 M CaCl2の144 μLを加えて混ぜます。HEPESバッファード生理生理生理(HBS)の1.92 μL(1.5 mM Na2HPO 4、140 mM NaCl、50 mM HEPES)をDNA溶液に加え、渦ですぐに混合します。
- 正確に60 s.28 mLの新鮮な細胞培養培地に溶液を移し、混合するために室温(RT)でインキュベートします。
- フラスコ内の培地をトランスフェクションミックスを含む細胞培養培地に置き換える。
- トランスフェクションの3日後、フラスコから廃棄物用の使い捨て容器にthr培地を注ぎ、収穫バッファーの5mLを追加して細胞を収穫する(EDTAはリン酸バッファー生理食塩水に添加し、材料の表、DPBSを最終濃度にする参照)5 mM)を各フラスコに5mM)の濃度で、細胞剥離を可能にする。
- 50 mL遠心管にセル溶液を注ぎます。各フラスコにさらに4 mLのDPBSを追加し、残りのセルとプールを最初の細胞溶液ですすいで下します。収穫した細胞を1,000 x gで遠心分離し、4°Cで5分間使用します。
- 遠心分離後、上清を除去し、渦によって溶解バッファーの15 mL(50 mMトリス-HCl pH 8.5、150 mM NaCl、1mM MgCl2)でペレットを溶解します。
- CO2-氷/エタノール浴で15分間凍結し、-20°Cの冷凍庫に保管します。使用前に37°Cの水浴で収穫した細胞を溶融します。
- AAV5ウイルスベクター精製
- Iodixanolグラデーション超遠心分離13によるAAV精製を行い、RTで1時間45分で350,000 x gの遠心分離管を使用します。
- 18G針で10 mLシリンジを使用し、AAV含有相を抽出するために、ベベルを上向きにして40/60%の位相境界線の下に約2mm挿入します。5-6 mL が抽出された後、タンパク質バンドに到達する前に停止してください。.
- グラデーションエキスをオートクレーブガラスボトルに4°Cで保管します。一晩よりも長い時間を保存することは避けてください。
- Iオジキサノール溶出(IE)バッファー(20mM Tris-HCl pH 8.0、15 mM NaCl)を旋回しながら12mLでゆっくりとピペッティングすることにより、Iodixanol勾配抽出物を3倍に希釈する。
- 希釈されたイオジキサノールの勾配を、アニオン交換フィルターを通して浄化し、濃縮します。1滴/s以下の速さでゆっくりと押し通し、フィルターを通してIEバッファの3 mLをゆっくりと押して洗います。
- 溶出バッファーの1-2 mL(20 mMトリス-HCl pH 8.0;250 mM NaCl)を備えた遠心フィルターユニットに溶出します。デバイスに DPBS を追加し、最終的なボリュームを 4 mL にします。RTで2,000 x gの遠心分離機は0.5 mL未満になるまでフィルタに残されます。チューブの底部から液体を取り出し、再びDPBSと遠心分離機の4 mLで補充します。この手順をもう 2 回繰り返します。フィルター上の濃縮ベクトルの体積が、最後の遠心分離ステップの後に約 200 μL であることを確認します。
- ピペットを使用して200 μL濃縮ベクトルを取り出し、0.22mmフィルターを通して濃縮物を押して殺菌します。アリコート 200 μLinto インターロックインサート付き9 mmガラスバイアル (材料の表)
注:AAV5ベクターストックは、長い貯蔵のために-80 °C冷凍庫に、または2週間以内に使用する場合は4°Cで保存することができます。
- AAV5ウイルスベクター力ライナー決定
- 反転末端反復(ITR)配列のプライマーを用いた標準的な定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)とITR配列(材料表)の5~FAM/3 33bHQ1プローブを用いてAAV5ツイターを決定する。プラスミドを含む既知の量のITRで達成された標準曲線を使用します。ITR配列が力価決定に使用される場合、各AAVベクターは1E+14 - 1E+15ゲノムコピー/ミリリットル当たり10000の範囲を有する必要があります。
注:成功したAAV5ウイルス生産は、3E+13 - 7E+13単位/mLの最小範囲でtitaを持つ株式を提供します。
- 反転末端反復(ITR)配列のプライマーを用いた標準的な定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)とITR配列(材料表)の5~FAM/3 33bHQ1プローブを用いてAAV5ツイターを決定する。プラスミドを含む既知の量のITRで達成された標準曲線を使用します。ITR配列が力価決定に使用される場合、各AAVベクターは1E+14 - 1E+15ゲノムコピー/ミリリットル当たり10000の範囲を有する必要があります。
2. 脳へのリプログラミング因子の注入
- 動物のセットアップ、立体的な配置と掘削
メモ：このプロトコルは、NG2グリアをインターニューロンにリプログラミングするためのAscl1、Lmx1aおよびNurr1(ALN)の使用に焦点を当てています。私たちの経験では、同様の表現型のインターニューロンは、他の因子の組み合わせを使用して得ることができます11歳.- 手術の前に、ベクターCba-FLEX-Ascl1、Cba-FLEX-Lmx1a、Cba-FLEX-Nurr1およびレポーターベクターSyn-FLEX-GFPを含むウイルスミックスを調製する。セクション1で調製した各株式を最終ミックスに追加し、最終的なウイルス溶液が各リプログラミング因子(Ascl1、Lmx1aおよびNurr1)のそれぞれ5%とレポーター構築物の10%(5%A、5%L、5%Nおよび10%GFP)を持たえるようにします。
注:AAV5ベクトルミックスは4°Cで保存でき、生体内での将来の使用のために保持することができます。 - 4:1比で空気と亜酸化窒素(N2O)を混合して2%イソファランを用いてマウスを麻酔する。横隔膜の動きを観察して、動物の呼吸を監視します。手術中は、1~1.5%のイソファルランを用いて麻酔を維持する。
注:本明細書に記載されるマウスモデルは、NG2グリアにおいてCreを特異的に発現するマウス株から構成される。生体内リプログラミングでは、グリア細胞の他の集団(例えば、アストロサイト14)でCreを発現する異なるマウス株を用いて達成することができる。 - 動物が完全に麻酔されたら(例えば、完全な筋肉の弛緩とフットパッドのピンチに対する応答なし)、切開部位の周りの領域を剃り、動物を立体フレームに連れて行く。
- 手術中の動物の体温を維持するには、ステレオタキスティックフレームのベースに加熱パッドを取り付けます。マウスを清潔で乾燥したペーパータオルの上に置きます。
- マウスの頭をイヤーバーに入れください。正しく配置された場合、頭部の横移動は観察されるべきではありません。マウスをステレオタキスティック フレームに配置する前に、左耳バーを 4 mm に設定します。
- 歯のバーを所定の位置に固定し、鼻バーを締めます。ヘッドが任意の寸法で動かないようにし、まっすぐ前方を指します(中線はイヤーバーの平面に対して垂直です)。眼の保護のための眼科のointmentを適用する。
- 手術開始前に、適切な鎮鎮鎮症(例えば、0.05mg/kgのブプレノルフィン、皮下)を投与する。
- 目の領域に近づかずに、綿のガーゼまたは70%EtOHを浸した拭き取りで切開領域をきれいにします。
注:脳内ウイルス注射には、引っ張られたガラス毛細血管を用いた5または10mLの注射器が使用される。ガラスキャピラリーは、マイクロピペットプーラーを使用して引っ張られ、非常に微細な先端を持つ毛細血管をもたらし、手順の侵襲性を最小限に抑えます。キャピラリーをシリンジに適応させるには、シリンジの針とガラス毛細血管の間の接続上にゴムチューブを使用し、熱源(例えば、ライター)を使用して溶かします。2つの部分間の密着は注入の間に液体漏れがないことを確認する。手術を開始する前に、生理生理生殖器で注射器を充填し、注射器から液体を押し出すことによってこれをテストします。 - 頭の中線に沿って約0.5〜0.8センチメートルの切開を行います。メスで、皮下層と皮下層の両方を切ります。
- 切開部の両側の皮膚フラップを広げます。任意の血液の切開をきれいにし、綿の芽で皮下層をこすり戻します。
- ステレオタックスフレームのM/L-D/Vアームを(動物の上)所定の位置に移動し、固定します。
注:立体フレームは、前部/後部(A/P、Y軸)、中間/横軸(M/L、X軸)および背部/腹部(D/V、Z軸)軸に沿って注射器の調節を可能にする。 - ステレオタックスフレームの異なる軸に沿ってシリンジを動かし、ガラス毛細血管の先端をブレグマのすぐ上(異なる頭蓋骨プレートが接する接合点)を持って来ます。
- 毛細血管の先端がA/PおよびM/L平面の両方で完全にまっすぐであることを確認してください。あいまいなブレグマの場合は、横線と中線の縫合糸の平均を取ります。
- 毛細血管の先端が正しくブレグマの上に置かれたら、デジタル座標カウンターでM/LとA/Pの両方の値を0.0にリセットします。
- 動物の頭部が完全に平坦な位置にあることを確認するには、デジタル座標カウンターを使用して、A/P アームが +2.0 および -2.0 (M/L = 0.0)の場合、および M/L アームが +2.0 および -2.0 (A/P = 0.0) の場合に、D/V 座標値を測定します。それに応じて、歯のバーとイヤーバーの高さを調整します。
- 線条体内のウイルスベクターの注入のための所望の座標に注射器を移動します (A/P = +1.0;M/L = -2.0(ブレグマに対して)。
- 注射器を少し上げ、顕微鏡で注射部位を見て、注入座標で歯科ドリルを使用して穴を開けます。円形で穏やかな方法で作業し、サイトで掘削を開始します。
注:ドリルビットは、追加の力なしで骨を通過するのに十分な鋭さでなければならないので、あまりにも多くの下向きの圧力を入れてはなりません。これは熱を作成するので、長く、持続的な掘削を避けてください。 - 掘削の最後に、デュラ母が無傷のままで、注入のために露出していることを確認します。
- 手術の前に、ベクターCba-FLEX-Ascl1、Cba-FLEX-Lmx1a、Cba-FLEX-Nurr1およびレポーターベクターSyn-FLEX-GFPを含むウイルスミックスを調製する。セクション1で調製した各株式を最終ミックスに追加し、最終的なウイルス溶液が各リプログラミング因子(Ascl1、Lmx1aおよびNurr1)のそれぞれ5%とレポーター構築物の10%(5%A、5%L、5%Nおよび10%GFP)を持たえるようにします。
- シリンジセットアップの準備
- 開いた切開部の上に綿のガーゼを置き、生理生殖器溶液で注射器を洗い流します。
- フラッシュ後、1~2μLの気泡を取り出し、続いてウイルスベクターを含む溶液を1μLにして、意図しない気泡を回避します。ウイルス溶液を注入しながら、気泡の下で容易に視覚化できることを確認してください。
- ウイルス注射
- 切開部位の上から綿のガーゼを取り出し、立体フレームのD/Vアームを使用してシリンジを下げる。頭蓋骨の表面が近づくにつれて、顕微鏡を注意深く見て、デュラ母のD/Vレベルを測定する - それは穏やかな圧力の下でわずかに膨らむ必要があります。
- 毛細血管の先端でデュラ母校に触れながら、D/V座標を0.0に設定します。
- シリンジを下げ、所望の深さまでゆっくりと進みます(D/V =-2.7、デュラ母校に対して)。針/毛細血管の曲がりが見ないように、軌道が骨片からはっきりと見えるようにしてください。
注:提示された座標は、NG2-Creマウスの線条体へのリプログラミング因子の注入を指す。他の脳領域に対応する座標を用いてもよい。新しいマウス株の脳にリプログラミング因子を注入する前に、常に染料(例えばトリパンブルー)、着色ビーズ注射またはレポーターウイルスベクターを使用して注入の座標を常にテストします。トリパンブルーを注射する場合、動物は手術直後に犠牲にされ、脳を解剖する必要があります。新鮮な脳は、凍結しながら、マイクロトームを使用して切断することができ、および脳内の色素位置の可視化によって決定される注射部位。着色ビーズを用いて座標をテストする場合、注入後1週間で注入および脳を切断した上で注射部位を決定することが可能である。あるいは、レポーター遺伝子を担持するウイルスベクターを用いた注射を用いることができ、また、注入部位は、注入の部位を切り取った脳で決定することができる。 - ウイルス溶液を0.4 μL/minの速度で1μL注入します。全容積が注入されるとき、注射器の引き出しの前に2分の拡散期間を許可する。
- 拡散後、毛細血管の先端が完全に脳から抜け出すまで、ゆっくりと注射器を引き込みます。
- 傷の上に綿のガーゼを置き、生理生殖器溶液で注射器を洗い流します。
- ステレオタックスフレームのM/L-D/Vアームを作業領域から外します。
- 創傷閉鎖および術後の手順
- 縫合糸を使用して切開部を慎重に縫合します。
注:注入された動物に使用されるすべての縫合糸は、抗ウイルス洗剤溶液を含むカップ/バイアルに配置する必要があります。同じ解決は外科材料と接触している外科区域を取り巻くすべての表面をきれいにするために使用される。すべての外科用具は各外科日の終わりに十分に洗浄され、オートクレーブされる。 - ステレオタックスフレームから動物を取り出し、清潔で加熱されたケージ、食べ物と水へのアクセス、および動物が完全に目を覚ますまで滞在する手術後のステーションに置きます。この期間中、意識が回復するまで動物を注意深く監視します。
- 前者が手術から完全に回復するまで、操作されていない動物を飼い入れしないでください。
- 毎日操作動物を監督します。使用する縫合糸に応じて、必要に応じて取り外してください。全ての動物は、術後ケアとしてブペノルフィナム(1ml/kgでテムジック)皮下を与えられた。
注:同じ注射器を2日間連続して使用する場合は、水で洗い流し、続いてエタノール70%と水を再び使用します。注射器は一晩水で満たされたままにして、可能な残留物の溶解を可能にする。
- 縫合糸を使用して切開部を慎重に縫合します。
3. 電気生理学的録音
- 電気生理学のための組織スライス製剤
注意:良好な電気生理学的記録を達成するためには、十分に実行された組織調製が必要である。慎重に部屋を準備し、氷の上に灌流と解剖のためのツールを配置します。- 氷冷と酸素化(95%O2および5%CO2)灌流、解剖および切断のためのクレブ溶液を調製する(超純水でストック溶液を希釈し、NaHCO3とブドウ糖を添加することにより、10倍のストックから同じ日にこれを準備します)。mMのクレブス溶液中の成分(希釈後1x)は次のとおりです:126 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4·H2O,1.3 MgCl2・6H2O,及び2.4 CaCl2・6H2O,22NaHCO3,10グルコース.溶液のpHを7.4に調整します。
- 新しいかみそり刃でビブラートムのキャリブレーション(ビブラチェック)を実行します。
- ビブラートムの冷却ブロックを開始(または氷で周囲のチャンバーを充填)、使用前に少なくとも30分前に95%O2および5%CO2で酸素化のためのKrebs溶液で切断室を充填します。
- 氷の上にペトリ皿を置き、酸素化クレブス溶液でそれを埋めます。ブレード、はさみ、取り付けプレートを氷の上に置きます。
注意:順応の手順を開始する前に、マウスを含むケージを少なくとも1時間部屋に持参してください。ストレスは、脳組織切片の状態に悪影響を及ぼします。 - ペントバルビタールの過剰摂取を注入してマウスを末期麻酔し、動物を眠らせます。 まばたき反射が出て、動物が痛みの刺激に反応しない場合は、2-3分間(10-20 mL/分の割合で)氷冷クレブス溶液で動物をトランスファールします。
- 迅速に、しかし慎重に、脳を解剖し、氷の上に置かれたペトリ皿(クレブス溶液を含む)に逆さまに置きます。
注:再プログラムされたニューロンの機能的成熟を比較するために、ウイルス注射後の異なる時間ポイントでの記録のために動物を犠牲にする。既存の文献15に基づいてニューロンの異なるサブタイプの発射特性を評価する。 - 中小脳に沿ってコロナカットを行い、ビブラート切断のために取り付けプレート(また氷冷)にこの側を接着します。
- 接着した脳をビブラートムの緩衝室に注意深く浸します。
注意:安全のためにカミソリの刃に触れないように注意し、ブレードが校正されたままになります。 - 脳の最もrostral部分から高速で線条体レベルにカットします。その後、遅い速度(0.10 mm/s)で275 mmで線条体を冠状に切断します。
- 各カットの後、慎重に非注入された線条体側(例えば、曲がった針で)を取り外し、水浴中に置かれた底ネット(RTで酸素化クレブス)を含む水浴中の別のバイアルに注入側を移します。すべてのセクションが切れるまで RT でこれを保持します。
- 水浴の温度をゆっくりと37°Cに上げ、30分間放置します。その後、ヒーターをオフにし、RTまで冷却してみましょう。
注: この時点で、録画を開始するまで一時停止できます。セクションは4-6時間続きます。
- 全セルパッチクランプ記録
- Krebs溶液の連続的な流れに沈んだ記録室に第1の組織部を移す。軽量を使用して断面を取り付け、目的を水没します。
- 顕微鏡で線条体領域を特定し、GFP陽性(再プログラムされた)ニューロンを検索します。形態に広範囲に及び、繊維束や血管でカバーされていないニューロンを選択します。
- パッチを当て、次の細胞内溶液(mM)で塗りつぶすためのホウケイ酸塩ガラスピペット(3-7 MΩ):122.5 KCl、0.2 EGTA、10 HEPES、2 MgATP、0.3 Na3GTPおよび8 NaCl、pH 7.3 KOHに調整。
- バイオシリン充填の場合、内部溶液および渦の1mLにバイオシリン塩を1mg加える。
注意:これはそうでなければ電極を詰まらせることができるので、バイオシチンで内部溶液をフィルタリングしてください。 - ガラスピペットを記録電極に取り付け、溶液に浸します。電極の抵抗を再確認します。その後、ゆっくりとピペットでセルに近づき、先端を差し込まないように電極にわずかな正圧を保ちます。
注意:電極を降下しながら細胞を追跡し、細胞内の蛍光を漂白しないように注意してください(つまり、必要でない場合は蛍光灯をオフにします)。 - 電極の正圧を用いて周囲の組織を慎重にすすいで、電極で細胞に近づく。細胞の上に電極を右に配置し、電極が膜に触れるまで降下します。電極と細胞膜の間にギガΩシールを作り、負圧パルスで膜を破裂させ、細胞全体のパッチを作成します。
注意:再プログラムされたニューロンは敏感です。パッチを当てる際には注意し、ギガ-Ωシールに到達したり、細胞膜を開いたりする際に、あまり負圧をかけすぎないようにしてください。また、古い動物にパッチを当てるには、結合組織が厚く、ニューロンを視覚化するのが難しいため、練習と忍耐が必要です。 - 現在のクランプモードで侵入した直後に休止膜電位を確認し、分析のために書き留めます。
- 現在のクランプでは、-60 mVから-80 mVの間のセルを維持し、-20 pAから+90 pAまで500ミリ秒の電流を注入し、10 pA増分して作用電位を誘導します。
- 電圧クランプに移し、10mVの脱分極工程で内側のナトリウムと遅延整流カリウム電流を測定します。
注:電圧クランプ記録は、膜をより効率的にクランプする化学物質で構成される別の内部溶液を使用して、より良い評価を受けます。しかし、再プログラムされたニューロンの場合、記録できる細胞の数は少なく、これらのニューロンを持つ組織切片の数は限られています。したがって、同じセルから電流クランプと電圧クランプの両方を記録するのが利点です。 - 電圧クランプモードでは、-70 mVで自発的なポストナプティック活性を記録します。-70 mVの興奮性イベントから0mVの膜電位で阻害後転記イベントを区別する。
- 安定したベースラインに達した後、ピクロトキシン、GABAA受容体拮抗薬を、記録室に流れ込むKrebs溶液に加え、興奮性イベントを抽出する(ピクロトキシンのストック溶液を別々に50mMの最終濃度に添加する)チャンバー灌流に接続されている緩衝注射器。安全な処分のための真空袋にチャンバからのバッファの流出を接続します。
- 20分後、AMPAアンタゴニストであるCNQX(20 mM)を記録室に流入するKrebs溶液に加え、阻害事象を遮断する(ピクロトキシンと同じ手順を使用して)。別の20分間放置し、クレブス溶液で洗い流します。チャンバから組織部を取り外します。
- 記録を終了した後、分析プログラムでしきい値イベント検出(>5 pA)を使用して、自発的興奮性興奮後シナプス電流(EPSC)および抑制性シナプス電流(IPSC)のオフライン分析を行います。
- 全体の記録の間に、細胞はゆっくりとバイオシチン含有内部溶液で満たされる。細胞の完全な充填を達成するために、ゆっくりと電極を取り外す前に、少なくとも20分間パッチを維持してください。
注意:その後、細胞の連続的な形態学的分析を破壊する可能性のある電極に正の圧力が付いないように注意してください。 - バイオシリン可視化の場合、組織部を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩4°Cに入れます。0.02 Mリン酸カリウムバッファー(KPBS)で0.1%のトリトンでセクションをすすいでください。次いで、ストレプトアビジン-Cy3(1:600 IN KPBS-T、2h)の染色は、バイオシチン充填細胞の同定および再プログラムされたニューロンの形態的可視化のために行った。
注:バイオシチン充填は、パッチを当てたニューロンの形態学的解析およびイラストに使用することができる。
4. 免疫組織化学、立体学、定量
注:電気生理学に用いられる組織切片は免疫組織化学に最適ではないため、免疫組織化学のための特定のグループを捧げる。
- ペントバルビタールの過剰摂取のi.p.注射でマウスを麻酔し、灌流のために動物をマウントする。
- 皮下にマウスを透過し、まず血液を取り除く生理食液を用いて、次に氷冷4%PFAを用く。
- 4%PFAで少なくとも12時間の脳とポストフィックスを解剖します。
- 約12時間(凍結保護用)25%ショ糖溶液に脳を入れてください。
注:脳は25%のショ糖溶液に沈むときに切断する準備ができており、スクロースがマウスの脳全体に浸透したことを示す。 - 小脳を横切って冠状動脈を切り取り、脳の平らで最もカジュアルな部分を使って脳をマイクロトームに置き、最適な切断温度化合物(OCT)を使用して所定の位置に固定します。
- 厚さ35mmの冠状動脈スライスに脳を切断し、0.02 M KPBSを含むバイアルまたはウェルに配置された連続したシリーズに脳を分割します。
- 標準プロトコル16、17に従って、GFPおよびGAD65/67、PV、チャット(コリンアセチルトランスフェラーゼ)およびNPY(ニューロペプチドY)などのGFPおよびニューロン間マーカーに対する抗体を用いて免疫組織化学のセクションを処理する。
注:脳スライスは、長期間凍結防止溶液中の4°Cまたは-20 °Cに保つことができます。 - 染色が完了したら、ガラススライドにセクションを取り付け、ガラスカバースリップでカバーし、取り付け液を使用して所定の位置に固定します。カバースリップしたスライドを一晩乾燥させておきます。
注:我々の研究では、全脳は1:8系列で切断される(すなわち、各バイアル含有セクションは、マウス脳11の8分の1を保持する)。 - 反転蛍光および/または共焦点顕微鏡を使用してセクションを分析します。
注意:蛍光顕微鏡は、結果の一般的な概要とリプログラミング効率を計算するための画像のキャプチャに役立ちます。二重陽性細胞の観察による方言的同一性のより詳細な分析のために、共焦点イメージングを使用する必要があります。 - 線条体中のGFP+ニューロンで発現される異なるマーカーの定量化のために、GFP+細胞の総数に関連する二重陽性細胞の数(すなわち、再プログラムされたニューロン)の数を、各々の少なくとも2つの分野でカウントする。線条セクション。
- 脳ごとの再プログラムされたニューロンのおおよその推定総数を決定するために、先に切断された脳系列の1つの線条体に存在するGFP+ニューロンをカウントし、次に系列の総数を掛けます。
注:異なる定量方法を使用して、リプログラミング効率、動物あたりの再プログラムニューロン数、および特定の表現型マーカーを発現するニューロンの割合を表すことができます。詳細については、前のパブリケーション11を参照してください。 - グラフパッドプリズムまたは類似を使用して条件の違いを分析します。
注:効率計算のために、CRE依存性ALN変換ベクターとGFPレポーターを用いてNG2-Creマウスを注入した。 変換効率を推定するために、我々はまた、ユビキタスcbaプロモーターの下でCre依存性GFPを持つ動物を注入し、すべての標的細胞GFP+をレンダリングした。この比較を用いて、標的細胞の66.81%±38.38%がニューロンに変換されたと推定した。各遺伝子の発現の検証のために、GFP/Ascl1、GFP/Lmx1aおよびGFP/Nurr1に対して相補的な二重免疫蛍光染色を行うことができる。さらに、単一細胞RNAシーケンシングなどのゲノムシーケンシングは、再プログラムされた細胞内の各遺伝子の存在を明らかにすることができる。
Representative Results
AAVベクターの注入は、NG2-Creマウス線条体(図1A)のニューロンに常駐NG2グリア細胞を正常に再プログラムするために使用される。NG2グリアを具体的に標的とするために、リプログラミング/レポーター遺伝子を持つFLEXベクターは、アンチセンス方向に挿入され、2組のアンチパラレル、異種loxP部位(図1B)によって横たわっている。3つのリプログラミング遺伝子(Ascl1、Lmx1aおよびNurr1)のそれぞれは、個々のベクター上のユビキタスcbaプロモーターの制御下に置かれる。GFP発現がCre発現細胞に由来する再プログラムされたニューロンに制限されることを確実にするために、GFPはニューロン特異的シナプシンプロモーターの制御下に置かれる(また、FLEXベクター中)。
リプログラミングとレポーター構築物の組み合わせを使用することで、マウス線条体におけるGFP陽性ニューロンの生成が可能になります(図1C,C')。リプログラミング遺伝子の存在なしにレポーター構築物を使用しても、GFP陽性ニューロンは得られなかった(図1D)。
バイオシリンが充填された再プログラムされたニューロンは、死後の免疫染色後に見える(図2A)。変換が成功した場合は、広範な神経形態が存在する必要があります。再プログラムされたニューロンの電気生理学的記録は、自発的な活動測定を伴う後の機能的接続の存在を示す(図2B,C)。これは、イオノートロピックGABA作動またはグルタマチン性遮断薬(ピクロトキシンまたはCNQX)のいずれかでブロックすることができ、再プログラムされたニューロンへの興奮性および抑制性シナプス入力の両方を示唆する。時間後ウイルス注射(図2D)により自発的活性の発生が増加し、徐々に成熟を示す。
現在誘発された作用電位は機能性ニューロンに存在する。変換後の時間の経過に大きいほどアクションポテンシャルが増加します (図 2E)。これはさらに神経機能の成熟を示す。未熟なニューロンでは、電流はいずれも、または非常に少ない作用電位を誘発する(図2F)。
ニューロンの発射パターンは、細胞の形態およびチャネル発現15などの要因に依存するので、細胞型特異的である。インビボ再プログラムされたニューロンの記録されたパターンは、グループに区別することができ、例えば、高速スパイクインターニューロン(細胞タイプB、図3B)または他の細胞タイプ(図3A、C、D)の内因性ニューロンサブタイプと比較することができます。).観察された電気生理学的差異は、GFPとの特定のサブタイプマーカーおよび共発現の存在によって確認することができる(図3E-H)。全体として、このデータは、線条体に存在する再プログラムされたニューロンが、パルブアルブミン、ChAt-およびNPY-発現インターニューロン、ならびに線条体中スピニーニューロン同一体(DARPP32+)のような異なるタイプのインターニューロンの特性を有することを示している。図 3E-H)。
図1:常駐NG2グリアをニューロンにインビボリプログラミングする。(A) 線条体NG2グリアの生体内リプログラミングにおけるAAVウイルス媒介の概略表現。(B) インビボリプログラミングに用いられるAAV5 FLEX構造の概略表現は、標的細胞におけるCre発現によって遺伝子発現が調節される。(CおよびC')生体内で再プログラムされたニューロンでは、StriatumへのSyn-GFP +ALN注射に起因する。 (D) 再プログラミング因子がウイルスカクテルに添加され、レポーター構築物のみが生体内に注入される場合に再プログラムされたニューロンが存在しない場合。スケールバー = 100 mm (C)、25 mm (C')、25 mm (D)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:生体内で再プログラムされたニューロンは機能的であり、時間の経過とともに成熟を示す。(A)バイオシリン充填再プログラムされたニューロンは、樹状脊椎を含む成熟した神経形態を示す。トレースは、ピクロトキシン、GABAA受容体アンタゴニストおよび(C)CNQX、AMPA受容体拮抗薬で遮断される興奮活性を有する(B)阻害性(GABAergic)活性を示す。(D) 経後の活動を伴うニューロンの数は、時間の経過とともに増加する。(E) パッチ付きニューロンは、注射後5週間(w.p.i.)で既に反復的な発火を示し、8および12 w.p.i.(F)現在誘発作用電位および未熟ニューロンの後のシナプス活性を示し続け、シナプスをほとんど示すBとD.スケールバー= 25mmと比較して、イベントと少数のアクションポテンシャルは、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図3:生体内で再プログラムされたニューロンは、線条体間ニューロンの免疫組織化学的および電気生理学的特性を示す。(A-D)生体内で再プログラムされたニューロンの発射パターンは、異なるタイプであることができます:(A) タイプAは内因性培地脊椎ニューロン(DARPP32+)に似ています。(B) 高速スパイク(PV+)インターニューロンに似ています。(C) 顕著なサグ(NPY+)を有する低閾値スパイクニューロンに似ています。(D) 大きな過極後に発射するニューロン(チャット+)。(E-H)GFPとニューロン間マーカーPV(E)、ChAT(F)、NPY(G)、および投影ニューロンマーカーDARPP32(H)の共局在を示す共焦点画像。すべてのスケールバー = 50 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
生体内では、Cre発現マウス株におけるAAV FLEXベクターを用いて直接リプログラミングを行うことができる。リプログラミングの有効性に関してマウス株間の違いが観察されていることに注意することが重要です。線条体の生体内リプログラミングでは、NG2-Creマウスラインは、他の株と比較した場合、より効率的であることが証明されています。新しい動物株を使用し始める前に、動物の年齢がしばしばこのタンパク質発現の特異性に影響を与えるので、時間の経過とともにCre発現に関するマウスプロバイダーのガイドラインをチェックすることが重要です。我々の研究では、NG2グリア以外の細胞でCre発現のリスクがあったため、12週以上の動物は生体内リプログラミングに使用されなかった。シナプシン-FLEX-GFP構造のみで注入された対照動物の一定の存在および監視が助言される。これにより、リプログラミング遺伝子(ALN)を使用しない場合に存在してはならないGFP陽性細胞の動物のモニタリングが可能になります。
新たにプログラムされたニューロンを同定するためには、このプロトコルに記載されているようなニューロン特異的同定方法が最も重要である。これにより、同所細胞におけるリプログラミング時に特に関連性のある内因性の周囲細胞から再プログラムされたニューロンを適切に同定し、区別することができます。
ウイルス注射のための正しい構造を標的にすることも重要です。したがって、ウイルス注射のための立体手術は重要であり、特に脳のより小さな構造を標的とする場合には、正確にアプローチする必要があります。
我々は以前に、同じリプログラミング因子を用いたインビトロリプログラミング実験に基づいて生体内リプログラミングの結果を予測することは信頼できないことを示した。したがって、関心のあるすべての要因は、生体内でテストする必要があります。私たちの手の中では、これらの遺伝子が他のニューロンの発達に関与しているにもかかわらず、多くの異なる因子の組み合わせがニューロンの同じサブタイプ(すなわち、生体内のニューロン11)を与えます。
再プログラムされたニューロンのための全細胞パッチクランプは繊細な技術であり、組織処理は良好な結果のために重要です。氷冷クレブス溶液との灌流はティッシュの質を改善する。また、パッチを当てたニューロンは慎重に治療する必要があります。再プログラムされたニューロンの成熟および発現性同一性が全細胞パッチクランプを用いて幾分評価できるとしても、これらの細胞は内因性の同等物と完全に比較できない。ゲノムシーケンシング(例えば、RNAシーケンシング)などの追加のタイプの分析は、再プログラムされた細胞同一性をさらに確認するために使用されるべきである。
ここに記載される技術は、脳内で神経置換が必要な将来の治療法の開発のために考慮することができる。生体内リプログラミングはまだ初期段階にあり、ヒトへの翻訳はまだ予見されていないが、この技術は脳内の外因性遺伝子機能を評価し、生体内の細胞成熟を研究する方法を提供する可能性がある。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
マルセラ・ビルテレは、マリー・スクワドウスカ・キュリー・イノベーティブ・トレーニング・ネットワークおよび交付契約第676408号の下で、欧州連合ホライズン2020プログラム(H2020-MSCA-ITN-2015)によって資金提供されています。ダニエラ・ライランダー・オットソンはスウェーデン研究評議会(2017-01234)から資金提供を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
| pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
| Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
| Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
| Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
| GFP-syn | AddGene | 30456 | |
| LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
| LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
| pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
| pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
| Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
| Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 | For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0 |
| EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G | For TE buffer use 1 mM EDTA |
| Ultrapure water | see Ultrapure water system | ||
| CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | For lysis Buffer: 1 mM |
| Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
| OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
| 10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
| Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
| Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 | Acrodisc unit with Mustang Q membrane |
| Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA | Amicon Ultra-4 device |
| Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
| Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
| Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
| Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
| Glass Vials | Novatech | 30209-1232 | CGGCCTCAGFGAGCGA |
| Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT | ||
| Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence | CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG | ||
| 5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
| 0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
| EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
| Freezer -20 °C | |||
| Freezer -80 °C | |||
| Fridge +4 °C | |||
| AAV viral room | |||
| Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
| Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
| Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
| Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
| Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
| Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
| ANIMAL MODEL | |||
| NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
| REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
| Water | |||
| Saline | Apoteket AB | 70% | |
| Ethanol | Solveco | ||
| Isolfurane | Apoteket AB | Dilute to 1% solution with warm water. | |
| Virkon | Viroderm | 7511 | |
| Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 | i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml. |
| Sucrose | Merck | S0389-500G | |
| Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
| Buprenorphine | Apoteket AB | ||
| EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | From RSG Solingen. | ||
| Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
| Tweezers | VWR | 232-0007 | |
| Forcep | VWR | 232-0120 | |
| Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
| Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
| Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
| Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 | 0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter. |
| Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
| Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
| Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
| Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
| Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
| Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
| Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
| Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
| Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M | From Covidien 2187. |
| Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
| REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | see Ultrapure Water system |
| Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
| KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
| CNQX | Merck | C239 Sigma | |
| Ice | |||
| EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
| Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
| Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
| WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
| Clampfit software | Molecular Devices | ||
| Multiclamp software | Molecular Devices | ||
| REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin. | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Donkey.Use at a concentration of 1 : 400. |
| Serum | Merck Millipore | S30-100ML | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| 4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | 1: 600 in KPBS-T. |
| streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
| Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
| Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
| Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
| Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
| Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
| Mounting solution | Merck | 10981 | Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading |
| OCT | Agar Scientific | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Distilled water | |||
| Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
| Prism | GraphPad | ||
| Microtome | Leica | SM2010R |
References
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