Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines pomalidomidbasierten, bifunktionellen Homo-PROTAC als einen neuartigen Ansatz zur Induzieren von Ubiquitination und Abbau des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), dem Ziel von Thalidomid-Analogen.
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Methodenartikel
Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle von der FDA zugelassenen Medikamente zur Behandlung von multiplem Myelom, induzieren Die Ubiquitination und den Abbau der lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3) über den Cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase für den proteasomalen Abbau. IMiDs wurden vor kurzem für die Erzeugung von bifunktionaler Proteolyse verwendet, die auf Chimären (PROTACs) abzielt, um andere Proteine zur Ubiquitination und proteasomalen Degradation durch die CRBN E3 Ligase zu zielen. Wir haben pomalidomidbasierte homobifunktionelle PROTACs entwickelt und synthetisiert und ihre Fähigkeit analysiert, eine selbstgesteuerte Ubiquitination und Abbau von CRBN zu induzieren. Hier dient CRBN als beides, die E3-Ubiquitinligase und das Ziel zugleich. Die homo-PROTAC Verbindung 8 degradiert CRBN mit einer hohen Potenz mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf IKZF1 und IKZF3. Die CRBN-Inaktivierung durch Verbindung 8 hatte keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit und proliferation verschiedener multipler Myelom-Zelllinien. Dieser Homo-PROTAC hebt die Wirkung von IMiDs in mehreren Myelomzellen auf. Daher können unsere homodimeren Pomalidomid-basierten Verbindungen helfen, die endogene Substrate und physiologischen Funktionen von CRBN zu identifizieren und den molekularen Mechanismus von IMiDs zu untersuchen.
Einleitung
Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle für die Behandlung von multiplem Myelom zugelassen, binden an die E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), ein Substratadapter für cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Die Bindung von IMiDs erhöht die Affinität von CRL4CRBN zu den lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3), was zu ihrer Ubiquitination und Degradation führt (Abbildung 1)4,
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Protokoll
1. Herstellung von PROTAC-Molekülen
VORSICHT: Bitte beachten Sie vor der Verwendung alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Mehrere der in diesen Synthesen verwendeten Chemikalien sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken und persönliche Schutzausrüstung.
- Zubereitung von tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbam (Verbindung 1)
- 1,1'-Carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) und eine katalytische Menge von 4-(Dimethylamino)pyridin (5 mg) in eine Mischung aus Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) in THF (50 ml) in 100 ml rund um den Bodenkolben mit ....
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Ergebnisse
Hier beschrieben wir das Design, die Synthese und die biologische Bewertung eines homodimer pomalidomidbasierten PROTAC zur Degradation von CRBN. Unser PROTAC interagiert gleichzeitig mit zwei CRBN-Molekülen und bildet ternäre Komplexe, die selbstallgegenwärtige und proteasomale Abbau von CRBN mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf pomalidomid-induzierte Neosubstrate IKZF1 oder IKZF3 induzieren.
Aus einer Reihe von zuvor v.......
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Diskussion
Das Design solcher homo-PROTACs, wie hier für CRBN beschrieben, beruht auf der spezifischen Affinität von Pomalidomid zu CRBN, die in zahlreichen heterobifunktionellen PROTACs erfolgreich eingesetzt wurde und zur Entwicklung von PROTAC 8 als hochgradig selektiven CRBN-Degrader. Die Spezifität unseres Moleküls wurde bereits durch proteomische Analysen bestätigt24. Für genetisch vermittelten Knockout ist der Ausschluss und die Validierung von Nebenwirkungen eine Herausforderung und .......
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Offenlegungen
Einen möglichen finanziellen Interessenkonflikt erklären die Autoren nicht.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 und SFB-1074 to J.K.; FOR2372 zu M.G.)
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,1'-Carbonyldiimidazol | TCI-Chemikalien | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylendioxy)-bis(ethylamin) | Sigma-Aldrich | 385506 | Verbindung 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalsäureanhydrid, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridin, 99 % | Acros | 148270250 | Giftiges |
| Acrylamidstammlö sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Zellsignalisierung | 15103S | |
| Anti-CRBN-Antikörper, hergestellt in Kaninchen | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-Kaninchen IgG HRP-gebundener Antikörper | Sigma | 7074S | |
| Ammoniumpersulfat | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI-Chemikalien | B1649 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Lumineszierender Zellviabilitätsassay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, wasserfrei, 99,8 % | Acros | 348435000 | Extra trocken über Molekularsieb |
| DMSO, wasserfrei, 99,7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry über Molekularsieb |
| Glycin | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Ziege Anti-Maus (HRP-konjugiert) | Santa Cruz Biotechnologie | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase-Inhibitor Einweg-Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab-Zellsignalisierung | 14859S | ||
| ImmobilonP-Transfermembran (0,45µ m) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethan, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Hochgiftiges |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2,5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini-Trans-Blot-Elektrophorese-Transferzelle | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertikale Elektrophoresezelle | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | Biomol (Cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoklonaler Anti-α-Tubulin-Antikörper, hergestellt in Maus (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamin, 99 % | Alfa Aesar A11801 | ||
| Fettfreies Trockenmilchpulver | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell Weiß Polystyrolplatte | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS-Probenpuffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomid | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Puffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| Natrium Dodecylsulfat | Carl Roth | 183.1 | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamat | Sigma-Aldrich | 89761 | Verbindung 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma-Base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL Spray | Advansta | K-12049-D50 |
Referenzen
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferati....
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Nachdrucke und Genehmigungen
