Summary
Ved hjelp av en tidligere konstruert enhet for å bruke mekanisk belastning på tilhenger celler, beskriver dette papiret en redesignet undergrunnen geometri og et tilpasset apparat for høyoppløselig enkelt celle bilde av anstrengte celler med en 100-og olje nedsenking objektiv.
Abstract
Ekstracellulære mekaniske belastninger er kjent for å lokke fram celle fenotypiske svar og har fysiologisk relevans i flere vev systemer. For å fange effekten av anvendt ekstracellulære strekk belastning på celle populasjoner i vitro via biokjemiske analyser, en enhet har tidligere blitt utformet som kan fabrikkert enkelt og er liten nok til å passe inn i vev kultur inkubatorer, så vel som på toppen av mikroskop etappene. Den tidligere utformingen av Polydimethylsiloxan-undergrunnen tillot imidlertid ikke høyoppløsnings subcellulære avbildning via olje-nedsenking mål. Dette arbeidet beskriver en redesignet geometri av Polydimethylsiloxan undergrunnen og en tilpasset Imaging oppsett som sammen kan forenkle høyoppløselig subcellulære avbildning av levende celler under anvendt belastning. Denne undergrunnen kan brukes med den samme, tidligere utformede enheten, og har derfor de samme fordelene som nevnt ovenfor, i tillegg til å tillate optisk bildebehandling med høy oppløsning. Utformingen av Polydimethylsiloxan undergrunnen kan forbedres ved å innlemme et rutenett som vil lette å spore den samme cellen før og etter påføring av belastningen. Representative resultater demonstrere høyoppløselig time-lapse Imaging av fluorescensmerkete merket kjerner innenfor anstrengt celler tatt ved hjelp av metoden beskrevet her. Disse kjernefysiske dynamikk data gir innsikt i mekanismen som brukes strekk belastning fremmer differensiering av oligodendrocyte stamceller.
Introduction
Celler og vev i kroppen er utsatt for ulike mekaniske signaler, inkludert strekk stammer. Men effekten av disse signalene på biologi av nevrale celler ennå ikke er studert grundig og forstått fullt. I det sentrale nervesystemet er kilder til mekanisk belastning inkludert utviklings vekst1,2,3,4, fysiologiske prosesser som for eksempel ryggmargen bøying, blod og spinalvæske pulsering, og patologiske tilstander som traumer, axon hevelse, gliacellene arrdannelse, eller tumor vekst5,6,7,8. Det er verdt å undersøke hvordan strekk belastningen påvirker differensiering av oligodendrocytes og den påfølgende myelination av axons, som er en kritisk prosess i virveldyr sentralnervesystemet. Ved hjelp av en spesialdesignet strekk enhet og elastomer multiwell plater, tidligere arbeider9,10 har vist at statisk uniaxial belastning kan øke oligodendrocyte differensiering via globale endringer i genuttrykk 10. for å få ytterligere forståelse av mekanismene for strekk mechanotransduction i disse cellene, må det tidligere eksperimentelle apparatet være redesignet som beskrevet her, for å muliggjøre høyoppløselig fluorescens avbildning av kjernefysisk dynamikk i levende celler under belastning. Nærmere bestemt, en enkelt-brønn Polydimethylsiloxan plate er utviklet, og Imaging konfigurasjonen er redesignet for å tillate tid-lapse Imaging av levende celler under belastning ved hjelp av en 100% olje nedsenking linse. For å eliminere de negative optiske effektene av Polydimethylsiloxan i lys veien, blir cellene avbildet ikke gjennom Polydimethylsiloxan platen, men i den omvendte posisjonen, gjennom dekkglasset som dekker celle rommet. Ved hjelp av denne nye Imaging design, hundrevis av høy oppløsning time-lapse filmer er registrert, av individuelle cellekjerner innenfor intakt tilhenger celler, der kromatin er merket med merking histone H2B til grønt fluorescerende protein. Disse filmene viser at strekk belastningen induserer endringer i kromatin struktur og dynamikk som er i samsvar med progresjon av oligodendrocyte differensiering.
Live celle avbildning under anvendt belastning er teknisk utfordrende og krever en enhetsutforming som er kompatibel med mikroskop systemet. Den tilpassede designen er beskrevet her presenterer et billig alternativ til kommersielle løsninger. Dens dimensjoner aktivere sin installasjon på mikroskop stadier og live celle Imaging ved høy romlig oppløsning under anvendt belastning. Bildebehandlings oppsettet er utformet for å muliggjøre levende celle bilde ved hjelp av en 100% olje nedsenking linse med den høyeste klarhet, gjennom dekselet glass, ikke gjennom laget av Polydimethylsiloxan plate som ellers reduserer bildekvaliteten og er vanlig i de fleste Bildeoppsett under belastning. Enheten, med en montert plate som inneholder celler, kan også lagres lett i inkubator. Denne enheten er utformet for å påføre uniaxial belastning på substrata som letter tilhenger cellekultur og opprettholder en stabil og ensartet belastning over flere dager. Oppsettet som er beskrevet her kan brukes for høyoppløselig bildebehandling av ulike tilhenger celletyper under belastning, noe som gjør det aktuelt å mechanotransduction studier i mange felt av celle mechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design av single-godt Polydimethylsiloxan mold for høyoppløselig bildebehandling
Merk: formen for produksjon av Polydimethylsiloxan plater er utformet med følgende funksjoner for å muliggjøre bildebehandling med en 100, olje nedsenking linse og en riktig passform i den tilpassede bygge belastningen heten (figur 1a, B).
- Hold den totale plate dimensjoner slik at den passer i klemmer av belastningen enheten.
Merk: Her er de 60 mm x 73 mm. - Lag en celle kupé eller godt som er betydelig mindre enn hele tallerkenen er lateral dimensjoner, for å unngå lysbuer (ut-av-flyet bøying) effekter som skjer ved unclamped kantene av Polydimethylsiloxan plate under anvendt belastning.
Merk: Her ble rommet designet som en 23 mm x 23 mm firkant. - Hold dybden på celle rommet så lite som mulig (ikke mer enn 80 μm), slik at du kan fokusere med den 100-olje nedsenking linsen gjennom dekkglasset plassert på toppen av rommet, men gjør det tilstrekkelig nok til å inneholde medier og for å unngå å kontakte eller klemme cellene.
- Hev celle rommet på en firkant med en høyde på 3 mm, for å bringe cellene nærmere linsen i det omvendte mikroskop oppsettet for å muliggjøre enkel fokusering.
Merk: muggsopp med de ovennevnte funksjonene kan produseres av mange teknikker, inkludert, for eksempel, valset aluminium. Alternativt kan Master muggsopp også monteres ved hjelp av akryl ark kuttet med en laser kutter, dekkglass #0 for cellen kupé, og super lim. Denne Master mold brukes til å lage en Polydimethylsiloxan forlaget, som deretter brukes til å lage arbeider muggsopp ved hjelp av en avstøpning harpiks.
2. fabrikasjon av single-brønn Polydimethylsiloxan plater og firkantede rom
- Bland Polydimethylsiloxan base og herding agent i et forhold på 20:1 (etter vekt) i en en gangs kopp. Veie totalt 20 g Polydimethylsiloxan per mold (for å lage en Polydimethylsiloxan plate) og 150 g Polydimethylsiloxan per 150 mm-i-diameter plast parabolen (for å lage en batch av firkantede rom).
- La Polydimethylsiloxan blandes i et vakuum avgasser på-0,8 bar i 30 min (eller til alle boblene er fjernet).
- Hell Polydimethylsiloxan blandes inn i formene (for plater) eller i 150 mm plast retter (for firkantede rom).
- Fjern eventuelle ekstra bobler på dette stadiet, enten ved å blåse luft (gjennom munnen) eller avgassing av Polydimethylsiloxan muggsopp/retter igjen på-0,8 bar vakuum i 30 min.
- La formene/rettene være i en ovn på 80 ° c på et utjevnings bord for 2 timer.
- Forsiktig fjerne formene/retter fra ovnen og la dem avkjøles til romtemperatur. Forsiktig skrelle ut herdet Polydimethylsiloxan etter nøye skjærekantene med et blad (figur 1C).
- På 150 mm-diameter Polydimethylsiloxan tegner du et 2 cm x 2 cm rutenett med en markør. Innenfor hver kvadrat, tegner en 1 cm x 1 cm firkant, etterlot en margin på 0,5 cm på alle sider. Ved hjelp av et blad, skjær forsiktig langs linjene for å få firkantede rom (figur 2a).
- Rengjør Polydimethylsiloxan platene/firkantede rom ved å incubating dem i 100% aceton for 4 h, etterfulgt av 100% etanol for 4 h, etterfulgt av autoklaveres vann til 4 h.
- Plasser platene/kvadratiske rom på parafin film bakside (ikke parafin film, men papiret) inne i en 150 mm diameter plast parabolen (figur 2C).
- La den Polydimethylsiloxan platen stå i 80 ° c ovnen for å tørke i 4 timer.
- Forsegle 150 mm-diameter retter som inneholder Polydimethylsiloxan plater og container firkanter med para fin film, og oppbevar dem i et kaldt rom til videre bruk.
3. funksjonalisering av Polydimethylsiloxan plater
- Fjern para fin filmen, Fjern dekselet av plast fatet, og plasser Polydimethylsiloxan platene og firkantede rom under ultrafiolett lys i 30 min.
- Plasma-Treat (ved 150 W i 5 min) Polydimethylsiloxan platene (med celle rommet vendt opp) uten firkantede rom, for å gjøre kulturen overflaten hydrofile.
- Umiddelbart plassere kvadratet rom på plasma-behandlet overflaten (figur 2b) og trykk manuelt for å midlertidig stikke de to sammen.
Merk: ikke plasma-behandle firkantede rom, ellers vil de holde seg sterkt til Polydimethylsiloxan plate og vil ikke komme ut lett når de må skrelles av under Imaging. - Tilsett 200 μL av 100 mM (3-aminopropyl) triethoxysilane til brønnen for 2 t for å innføre-NH2 grupper til den Polydimethylsiloxan overflaten. For å lage en 100 mM oppløsning, oppløses 234 μL av ren (3-aminopropyl) triethoxysilane i 10 mL vann. Etter en 2 h inkubasjons, vask brønnene 3x med deionisert vann.
- Veie 2 mg av molekyl tverrbinder bissulfosuccinimidyl suberate og oppløse den i 700 μL av 1 M (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfonsyrer syre buffer (pH 8,0) og 2,8 mL vann.
Merk: Dette vil gi en 1 mM bissulfosuccinimidyl suberate oppløsning i 200 mM (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfonsyrer acid buffer. Merk at en 50 mM konsentrasjon buffer også fungerer godt.- Tilsett 135 μL av denne løsningen og 15 μL av 1 mg/mL fibronektin brønnen i hver Polydimethylsiloxan plate i 4 timer ved romtemperatur.
- Vask 3x med fosfat-bufret saltløsning. Tilsett 500 μL av fosfat-bufret saltvannsoppløsning på brønnen. Dekk til 150 mm-diameter parabolen inneholder Polydimethylsiloxan med parafin film og oppbevar den i et kaldt rom, inntil videre bruk.
4. funksjonalisering av plast retter og flasker
- Ruge plast retter og flasker med en 5 μg/mL oppløsning av Poly-D-lysin (PDL, i sterilt vann) for 1 h. Tilsett 1,5 mL av denne løsningen (ligand) per 35 mm diameter parabol, 3 mL av den per 60 mm diameter parabol, og 10 mL per 75 cm2 kultur kolbe.
- Vask rettene og flaskene 2x med sterilt vann.
- La dem tørke i det biosafety skapet i 1 time (eller til det er tørt) og oppbevar dem i det kalde rommet ved 4 ° c inntil videre bruk.
5. spredning og differensiering medium for murine oligodendrocyte stamceller
- Forbered 50 mL av 100% løsninger av spredningen og differensiering medium, gjør alikvoter av 2,5 mL, og oppbevar dem ved-80 ° c.
Merk: sammensetningen av sprednings medium er 0,1 mg/mL blod serum albumin, 62 ng/mL progesteron, 16 μg/mL putresin, 5 μg/mL insulin, 50 μg/mL Holo-transferrin, 5 ng/mL natrium selenitt, 1x penicillin-Streptomycin, 10 ng/mL plate-avledet vekst faktor, og 10 ng/mL Fibroblast vekstfaktor i Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) med høy glukose og pyruvat. Mens storfe serum albumin, progesteron, putresin, og natrium selenitt kan være konstituert og lagres på 100 x, insulin, Holo-transferrin, og penicillin-Streptomycin må tilsettes friskt mens forberede 1x løsning. Vekst faktorene må være konstituert ved 10 μg/mL og må tilsettes friskt til cellene hver dag (1 μL/mL medium). Sammensetningen av differensiering medium er 0,1 mg/mL blod serum albumin, 62 ng/mL progesteron, 16 μg/mL putresin, 5 μg/mL insulin, 50 μg/mL Holo-transferrin, 5 ng/mL natrium selenitt, 1x penicillin-Streptomycin, 400 ng/mL triiodothyronine, 400 ng/mL L-Thyroxine, og 0,5% fosterets storfe serum i DMEM med høy glukose og pyruvat. Triiodothyronine og L-Thyroxine kan være konstituert med andre reagenser og oppbevares ved 100%. Insulin, Holo-transferrin, og penicillin-Streptomycin må tilsettes friskt mens forberede 1x løsning. - For å forberede 50 mL av 100 mg sprednings medium, oppløses 510 mg av blod serum albumin i 17 mL av Dulbecco medium, 310 μg av progesteron hos 31 μL av etanol, 80 mg putresin i 500 μL av Dulbecco medium, 25 mikrogram natrium selenitt i 10 μL av Dulbecco medium og full DMEM opptil 50 mL
- For å forberede 50 mL av 100 mg oppløsning av differensiering, kan du i tillegg løse opp 2 triiodothyronine i 40 μL av natriumhydroksid og 2 mg L-Thyroxine i 40 μL av natriumhydroksid, og deretter fylle opp løsningen til 50 mL med Dulbecco medium. Filtrer løsningen gjennom en steril en gangs Filterenhet, alikvot og oppbevar alikvoter ved-80 ° c.
- For å forberede 250 mL av 1x spredning/differensiering medium, bland 2,5 mL av 100 x oppløsning av spredning/differensiering medium med 12,5 mg Holo-transferrin, 125 μL av 10 mg/mL insulin, og 2,5 mL av 100-Streptomycin. Fyll opp oppløsningen til 250 mL med Dulbecco medium og Filtrer den gjennom en steril en gangs Filterenhet.
Merk: vekst faktorene må legges friskt og direkte til celle kulturen, ikke til hele partiet av rekonstituert medium.
6. cellekultur
- Start med oligodendrocyte stamceller suspendert i spredning medium. Seed disse cellene i en tetthet på 35 000 celler/cm2 til PDL-belagt plastoverflater (retter eller flasker, se pkt. 4). Juster volumet på sprednings mediet til 3 mL per 10 cm2 av overflatearealet av plast undergrunnen; et lavere volum på medium kan føre til celle klumper som oppstår fra overflate spennings styrker, mens et høyere volum av medium i rettene kan forårsake søl.
- Legg vekstfaktorer (blodplater avledet vekstfaktor og fibronektin vekstfaktor) hver dag, opprettholde sin konsentrasjon på 10 ng/mL og endre halvparten av spredningen medium på alternative dager.
- På den tredje dagen, løsne cellene fra plastoverflaten ved hjelp av en skånsom celle avløsning løsning (f. eks accutase): fjerne mediet, vask 1x med fosfat-bufret saltløsning, tilsett 1 mL løsgjøring løsning per 20 cm2 område, la parabolen/kolbe i en inkubator ved 37 ° c i 10 min, og trykk forsiktig på den til alle cellene har løsnet (se under et mikroskop).
- Pipetter ved hjelp av en 200 μL-spiss for å bryte klumper i enkeltceller, overføre dem til et 50 mL rør, fortynne dem i sprednings medium, spinne ved 0,2 x g i 10 min, forkaste supernatanten og resuspend pellet i sprednings medium for å lage et total volum på 1 ml. Tell cellene ved hjelp av en flowcytometer.
- Vask de fibronektin-funksjonalisert Polydimethylsiloxan platene 2x, 15 min per vask, med sprednings medium.
- Seed 35 000 celler per Polydimethylsiloxan plate i 700 μL av sprednings medium.
- Legg til en plasmider konstruksjon av H2B-GFP for merking histone H2B med grønt fluorescerende protein.
Merk: her 1,4 μL av CellLight H2B-GFP BacMam2 transfeksjoner mix ble tilsatt til hver plate (2 μL per 50 000 celler). - Etter 24 h, Monter Polydimethylsiloxan prøvene med celler som skal strekkes på uniaxial belastning enhet (som vist i figur 2D). Endre mediet i alle prøvene til differensiering medium.
- For å anstrenge prøvene, mål unstrained lengde på celle rommet (figur 3a) og drei på scene mikrometer skruen for å øke lengden på celle rommet med ønsket mengde (f.eks. 10%, se figur 3b). La de utstrakte og unstretched Polydimethylsiloxan prøvene i inkubator ved 37 ° c til bildebehandling.
7. avbildning
- Slå på mikroskopet. Angi inkubator temperaturen til mikroskopet til 37 ° c.
- Bring målet som skal brukes (100 a olje nedsenking) til den sentrale posisjonen som objektiv turret vil ikke være tilgjengelig senere. Skru løs målet og skru det sammen igjen med en objektiv ring (figur 4a) slik at målet kan bringes nærmere cellene. Hvis et olje mål brukes her, legger du til en dråpe olje på dette trinnet.
- Syntetisere på forhånd (via 3D-utskrift eller maskinering) en plastikk eller metall holder som har to viktige funksjoner-et vinklet vindu og et trinn (figur 4b).
Merk: vinduet støtter en tykkelse #0 glass dekkglass som vil holde mediet mens belastningen enheten er i en invertert tilstand. Den vinklede kutt på vindus kantene (figur 4d) gjør at målet å komme nærmere glasset dekkglass. Trinnet i holderen tillater oss å bringe strukket Polydimethylsiloxan lenger ned, nærmere målet. - Plasser et glass dekkglass (tykkelse #0, med dimensjoner på 25 mm x 25 mm eller 35 mm i diameter) på den øverste overflaten av holderen ved å spre vakuum fett i utkanten av vinduet (figur 4c), og tape plast vinduet på mikroskopet scenen ( Figur 4D og figur 5a).
- Skru en z-oversettelse scenen på mikroskopet scenen og flytte den til den øverste z-posisjon (figur 5a).
- Fjern 500 μL av mediet fra den utstrakte Polydimethylsiloxan platen for å bli avbildet og legg dette mediet på glass dekkglass i det hvite plast vinduet.
- Løsne det firkantede rommet forsiktig fra Polydimethylsiloxan plate med steril pinsett.
- Hold belastningen enheten i oppreist stilling (celler vendt opp) over den hvite plast vinduet og forsiktig invertere belastningen enheten slik at eventuelle ekstra medium slippe direkte i midten av glasset dekkglass (figur 5B) (celler vendt nedover).
- Plasser den nederste delen av belastningen heten på z-Oversettelses fasen med dobbeltsidig tape (figur 5c, D).
- Mens du ser gjennom okularet under brightfield, sakte bringe belastningen enheten ned (figur 5e) (ved å senke z-oversettelse scenen) og flytte målet opp til å fokusere på cellene.
- Utfør dette trinnet svært langsomt, trinn for trinn. Hvis belastningen enheten presser for mye på dekkglass, cellene kan få komprimert (forårsaker dem til å dø), og hvis målet presser for mye på dekkglass, kan dekkglass bryte (forårsaker medium å lekke og søl på mål).
- Skann Polydimethylsiloxan platen i x-og y-retninger for å finne en celle som har en fluorescerende kjerne (under epifluorescence med 488 NM av bølgelengde eksitasjon) og passende celle morfologi (under brightfield).
- Hvis den laterale forskyvning av mikroskopet scenen ikke påvirker vertikal fokusering for mye, velger du flere områder av interesser ved hjelp av en flerpunkts funksjon på programvaren. Noen ganger er fokus svært følsom for noen lateral forskyvning av scenen. I slike tilfeller bilde en celle om gangen. Merk x-, y-og z-posisjonene for hver celle av interesse.
- Record bred-feltet (eller åpne-pinhole) bilder av kjernen med 488 NM bølgelengde eksitasjon og av cellen med brightfield eksitasjon med intervaller på 30 s per ramme for en total varighet på minst 30 min.
8. data analyse
-
Kjernefysiske svingninger
- Åpne sekvensen av nucleus bilder (figur 6a) i et bildeanalyse programvare og terskelen kjernen time-lapse bilder (for eksempel bruke terskel kommandoen i ImageJ eller GRAYTHRESH kommandoen i programvaren MATLAB).
- Få kjernen området (i piksler) som en funksjon av tid, plotte det i en data plotting programvare (figur 6b), og passer en tredje ordre polynom til data (figur 6C) (for eksempel bruke analyse | Montering | Polynom Fit -kommandoen i Origin eller Polyfit -kommandoen i programvaren MATLAB).
- Trekk verdien til den monterte polynom fra det faktiske området (i piksler) for hvert tids punkt. Dette korrigerte området er kjent som det gjenværende området.
Merk: denne prosessen fjerner en økende eller synkende trend i dataene som kommer fra instrumentale feil og kalles detrending.- Beregn prosentandelen av rest arealet ved å dele det resterende området på hvert tidspunkt med verdien av den monterte polynom på det tidspunktet (figur 6D).
- Beregn standardavviket i tidsserien for det gjenværende området. Dette standardavviket betegner amplituden til de kjernefysiske svingningene.
-
Data plotting og statistisk analyse
- Beregn amplituden av kjernefysiske svingninger som en middelverdi på minst 20 kjerner per tilstand.
- Gjennomføre en enveis analyse av varians statistisk test med Bonferroni korreksjon for å fastslå om det er en betydelig forskjell i amplitude av svingninger som en funksjon av forhold av interesse (for eksempel med og uten påført belastning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyere arbeid med sikte på å undersøke effekten av strekk belastningen på oligodendrocytes10 viste at en 10% uniaxial strekk belastning fremmer differensiering av oligodendrocyte stamceller ved globale endringer i genuttrykk. Mekanismen bak disse endre inne gen gjengivelsen kan analysert via det tenkelig av subcellulære parameterene, som det cytoskeleton struktur, transkripsjon faktoren lokaliseringen, atomer dynamikk, og kromatin organisasjon. Den forrige geometrien til den Polydimethylsiloxan undergrunnen tillot imidlertid ikke høyoppløselig enkelt celle bildebehandling. Som beskrevet i dette arbeidet, har den nydesignede geometrien i Polydimethylsiloxan undergrunnen og avbildnings oppsettet minimert avstanden mellom cellene og målsettingen. Dette gjør det mulig å ta tidsforløpbilder av fluorescensmerkete merket cellekjerner ved hjelp av et 100-mål for olje nedsenking (figur 6a).
Svingninger i det kjernefysiske projiserte området avhenger av differensiering tilstand av cellene11,12. En sammenligning av de kjernefysiske svingningene i oligodendrocyte stamceller og at av uhelbredelig differensiert oligodendrocytes viste at sistnevnte har signifikant lavere svingninger (figur 6e). Deretter ble den kjernefysiske svingninger av oligodendrocyte stamceller ved 1 h, 24 h, og 48 h post-kjemiske induksjon av differensiering med og uten en 10% strekk belastning sammenlignet. Med kjemisk induksjon alene viste amplituden til de kjernefysiske svingningene en signifikant nedgang ved 48 h, men ikke ved 24 timer (fig. 6F). På den annen side, kjemisk induksjon sammen med en 10% strekk belastning viste en betydelig nedgang på 24 h, som forble konstant, uten ytterligere reduksjon på 48 h (figur 6G).
Den undergrunnen geometri og Imaging konfigurasjonen beskrevet i denne utredningen aktivert innspillingen av høyoppløselige filmer av anstrengte celler. Påfølgende analyse av disse filmene viste at belastningen fremskynder demping av kjernefysiske svingninger, som er en markør for differensiering. Disse resultatene gir innsikt i den mekanismen som belastningen fremmer oligodendrocyte differensiering. Videre drøfting av tolkningen av disse resultatene og fremtidige eksperimenter er beskrevet i Makhija et al.13.
Figur 1: Design og geometri av Polydimethylsiloxan mold. (A) skisse av mold viser alle dimensjoner i millimeter (denne skissen ble generert av whits teknologier, Singapore). (B) tredimensjonal visning av mold (tilpasset fra Makhija et al.11). Innfelt viser et bilde av mold. (C) tredimensjonal visning av Polydimethylsiloxan platen fabrikkert ved hjelp av mold (tilpasset fra Makhija et al.11). Innfelt viser et bilde av Polydimethylsiloxan plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Prøve forberedelser. (A) bilde av en Polydimethylsiloxan plate og et firkantet rom. (B) plassen rommet er plassert på hevet firkant på Polydimethylsiloxan plate. Formålet er å inneholde medium for cellene. (C) Polydimethylsiloxan platene er lagret i 150 mm-diameter plast retter ved hjelp av parafilm papir for å hindre Polydimethylsiloxan fra å stikke på plasten. (D) under montering av platen på belastningen enheten, støtte den fra bunnen med to fingre for å hindre at noen sagging av platen. Hvis platen fortsatt sags litt etter montering, øke avstanden mellom belastningen enheten armene ved å dreie oversettelsen scenen. På dette trinnet, bør oversettelsen av scenen ikke indusere belastning i Polydimethylsiloxan plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: celle strekking. (A) mål den opprinnelige lengden på platen mellom klemmene, ved hjelp av en linjal. (B) strekke platen ved å dreie skruen på oversettelsen scenen for å øke den første plate lengde med ønsket prosentandel. X% økning i lengde tilsvarer X% av belastningen. Merk at for å generere ønsket belastning (X%) i hevet cellekultur kupé, må hoved platen være anstrengt med et høyere beløp (ca 2X%) på grunn av forskjellen i deres tykkelse i den beskrevne plate geometri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Forberedelse til bildebehandling. (A) Bring den 100 målsettingen til den sentrale posisjonen i dreieskiven, skru ut målet og skru det sammen igjen med objektivringen. (B) skisse av holderen som viser alle dimensjoner i millimeter. (C) spre vakuum fett i utkanten av vinduet i holderen, ved hjelp av en pipette spissen, og plassere et glass dekkglass på toppen. Bruk et dekkglass med tykkelse #0 eller #1, slik at du kan fokusere med den 100% olje nedsenking linsen. (D) Plasser holderen (1) på mikroskopet (2). Bring olje (6) objektiv (3) nærmere dekkglass (5) som sitter fast til holderen, ved hjelp av vakuum fett (4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bildeoppsett på mikroskopet. (A) Monter z-Oversettelses fasen (gul pil) og holderen (rød pil) på mikroskopet. (B) Vipp belastnings enheten på mikroskopet for å la enhver medium dråpe på glass dekkglass på holderen. Stick en dobbeltsidig tape (blå pil) på belastningen enheten som vil holde seg på z-oversettelse scenen. (C) plasser strekk enheten i en invertert posisjon, og støtt den på z-Oversettelses fasen. Cellene må være på linje med glass dekkglass på plastholderen. (D) invertert geometri på belastnings enheten minimerer avstanden mellom cellene og målet, og dermed Letter bildebehandling med høy oppløsning (tilpasset fra Makhija et al.11). (E) side visning før du bringer belastnings enheten ned (1); sidevisning etter at du har brakt belastnings enheten ned (2); etter at du har brakt belastnings enheten ned (3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representative bilder og areal svingninger data av kjernen. Dette tallet er tilpasset fra Makhija et al.11. (A) typisk bilde av en kjerne merket med histone H2B merket til grønt fluorescerende protein, og en differensiering oligodendrocyte Stamcelle. Kjernen er i fokus, mens celle prosessene er ute av fokus. (B) typisk tidsserie for et kjernefysisk område (i piksler). (C) tredje ordre polynom montert på dataene. (D) prosentandel av det gjenværende området av svingninger i tidsserien. (E) kjernefysisk kant svingninger av voksende oligodendrocyte stamceller og døds differensiert oligodendrocytes. (F) Nuclear Edge svingninger ved 1 h, 24 h, og 48 h postinduction av kjemisk differensiering uten belastning. (G) kjernefysisk areal svingninger ved 1 h, 24 h, og 48 h postinduction av kjemisk differensiering med 10% strekk belastning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enhet har tidligere1 blitt designet for anvendelse av ekstracellulære strekk belastning på tilhenger celler. Utformingen av Polydimethylsiloxan undergrunnen i dette arbeidet var tilstrekkelig for biokjemiske analyser, samt lav oppløsning Imaging av strukket celler. I dette arbeidet, undergrunnen ble redesignet, og en roman Imaging konfigurasjon som forenkler høyoppløselig subcellulære Live celle Imaging ble innført. Fordelene med dette systemet er mange: det kan bygges i laboratoriet ved hjelp av enkle komponenter, er det rimelig i forhold til kommersiell belastning enheter (500 USD per celle belastning enhet), og det er liten nok til å passe inn i vev kultur inkubatorer, så vel som på Mikroskop. Videre, selv om bilde systemet har blitt beskrevet her med det omvendte mikroskopet oppsettet, kan det lett justeres for oppreist mikroskop konfigurasjonen.
Det er noen viktige trinn involvert i prøven forberedelse og Imaging. Først må Polydimethylsiloxan platene og firkantede rom rengjøres grundig før celle seeding (protokoll trinn 2,8) for å sikre celle overlevelse (som uherdet Polydimethylsiloxan er giftig for celler). For det andre, siden volumet av Fluid medium som kan passe inn i plassen rommet er mindre enn 1 mL, kan det fordampe hvis prøven er i inkubator for et par dager. Derfor må mediet sjekkes hver dag og etterfylles ved behov. I tillegg kan hevet område på Polydimethylsiloxan plate dekkes med en invertert 60 mm diameter plast parabolen å minimere fordampning. For det tredje må du utvise ekstrem forsiktighet mens du flytter belastnings enheten på mikroskopet ned via z-Oversettelses fasen for å få cellene nærmere glass dekkglass. Komprimere cellene (selv for et øyeblikk) mellom Polydimethylsiloxan undergrunnen og glass dekkglass kan forårsake celle død. For det fjerde kan de døde cellene og celle rusk forbli fast til glasset dekkglass etter at Polydimethylsiloxan prøven er fjernet. Derfor, etter tenkelig, glasset dekkglass må trekkes av fra vakuum fett og en frisk dekkglass bør festes før montering en ny prøve.
Begrensningene av belastningen enheten er at anvendelsen av scenen lateral forskyvning ikke kan programmeres til å utføre syklisk eller ramped belastning, og at det kan bare gjelde uniaxial belastning. Begrensningen av Polydimethylsiloxan undergrunnen i den beskrevne geometrien er at en belastning høyere enn 25% kan forårsake brudd i Polydimethylsiloxan.
En fremtidig modifikasjon for å forbedre utformingen av Polydimethylsiloxan undergrunnen kan være inkorporering av et rutenett på cellen kulturen overflaten. Dette vil tillate for å spore den samme cellen før og etter påføring av strekk belastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Alle forfatterne takknemlig erkjenner finansiering støtte fra National Research Foundation i Singapore gjennom Singapore-MIT Alliance for forskning og teknologi (SMART) BioSystems og Mikromekanikk (BioSyM) tverrfaglig forskergruppe. Forfattere Dr. Jagielska og Dr. Van Vliet også takknemlig erkjenner finansiering og støtte fra saks-Kavanaugh Foundation. Forfatterne takker William Ong og Dr. Sing Yian chew fra Nanyang Technological University, Singapore, for å gi rotte oligodendrocyte stamceller for noen eksperimenter beskrevet i dette arbeidet, og forfatterne takker Dr. G. V. Shivashankar fra Mechanobiology Institute, University of Singapore, Singapore, for diskusjon om kjernefysiske område svingninger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS - Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold - Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 - Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
