מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft
Summary
המטופל נגזר מבע (pdx) דגמים נוספים ביותר בסדר מלנומה מולקולרית תכונות ביולוגיות, הם ניבוי יותר של תגובת הטיפול לעומת רקמה פלסטית מסורתית התרבות מבוסס assays. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ההפעלה הסטנדרטית שלנו להקמת דגמי PDX חדשים ואפיון/ניסויים של דגמי PDX קיימים.
Abstract
צבירת ראיות עולה כי תכונות מולקולריות וביולוגיות שונות בתאי מלנומה גדל בתוך כלי התרבות המסורתית דו מימדי רקמות לעומת בvivo בחולים אנושיים. זה בשל בחירת צוואר הבקבוק של אוכלוסיות שבטים של תאים מלנומה שיכול לצמוח ברוטי בחוץ בהעדר מצבים פיזיולוגיים. עוד, התגובות טיפול בתרבויות דו מימדי רקמות הכולל לא בנאמנות לשקף התגובות טיפול בחולי מלנומה, עם רוב הניסויים הקליניים נכשל להראות את היעילות של שילובים טיפוליים המוצג להיות יעיל ב מבחנה. למרות שתלה שתלה של תאים מלנומה לתוך עכברים מספק את הפיסיולוגיים בהקשר vivo נעדר משני מימדי התרבות רקמה, התאים מלנומה המשמשים לחרט כבר עברו בחירת צוואר בקבוק עבור תאים שיכולים לצמוח תחת תנאים דו-ממדיים כאשר קו התא הוקם. השינויים הבלתי הפיכה המתרחשים כתוצאה של צוואר הבקבוק כוללים שינויים במאפייני הצמיחה והפלישה, כמו גם הפסד של אוכלוסיות משנה ספציפיות. לכן, מודלים כי טוב יותר ללכוד את המצב האנושי vivo אולי טוב יותר לנבא אסטרטגיות טיפוליות המגבירים ביעילות את ההישרדות הכוללת של חולים עם מלנומה גרורתית. המטופל נגזר מבע (pdx) טכניקה כרוכה השרשה ישירה של תאים סרטניים מהמטופל האנושי לנמען העכבר. באופן זה, תאים סרטניים גדלים בעקביות תחת מתחים פיזיולוגיים בvivo ולעולם לא לעבור בקבוק דו מימדי, אשר שומר על המאפיינים המולקולריים והביולוגיים נוכח כאשר הגידול היה החולה האנושי. הבולטים, PDX מודלים נגזר מאתרי איברים של גרורות (כלומר, המוח) להציג קיבולת גרורתית דומה, בעוד מודלים PDX נגזר מחולים תמימים תרפיה וחולים עם עמידות לטיפול (כלומר, BRAF/מעכב מעכבי טיפול) להציג רגישות דומה לטיפול.
Introduction
מודלים preclinical הם קריטיים עבור כל ההיבטים של מחקר הסרטן translational, כולל אפיון המחלה, גילוי של פגיעויות שימושי ייחודי לסרטן לעומת תאים נורמליים, ופיתוח של טיפולים יעיל לנצל פגיעויות אלה כדי להגביר את ההישרדות הכוללת של חולים. בשדה מלנומה, עשרות אלפי דגמים של קו התא כבר מנוצל בכבדות עבור הקרנת סמים, עם > 4000 תרמה על ידי הקבוצה שלנו לבד (סדרת WMXXX). אלה מודלים קו התא נגזר מחולי מלנומה עם צורות שונות של מלנומה עורית (כלומר, acral, uveal, ו התפשטות שטחית) ו גנוסוגים מגוונים (כלומר, BrafV600-מוטציה ו נוירובלסטומה RAS ויראלי אונאוולוג הומולוג [ מיכל הנברס Q61R-מוטציה]), אשר תוחלת את הספקטרום של המחלה הנוכחית בקליניקה1,2.
חד-משמעית, המוצלח ביותר, טיפול ממוקד האסטרטגיה בשדה מלנומה התפתחה מ 1) האפיון גנומית של גידולים של חולים לזיהוי מוטציות Braf ב ~ 50% של מלנומה3 ו מ 2) חקירה פרה-קלינית מינוף קו מלנומה תא מודלים4. שילוב BRAF/מק מעכב היה מזון ותרופות מינהל (FDA)-אושרה ב 2014 לטיפול בחולים אשר הנמל מלנומה הפעלת brafV600E/K מוטציות ומתגאה > 75% תגובה שיעור5. למרות היעילות הראשונית הזאת, ההתנגדות מתעוררת במהירות כמעט בכל מקרה בשל מנגנונים מהותיים ושנרכשו מנגנוני ההתנגדות טרוגניות. למרבה הצער, מודלים של קו התא אינם מטרוגניות ביולוגי נציג מייצג כאשר גדל בתרבות דו-ממדית בכלי פלסטיק, אשר מסכות הפוטנציאל החזוי הקליני שלהם כאשר חוקרים מנסים לקבוע את טיפולים שעשויים להיות יעילים בחולים עם טופס מסוים או גנוטיפ של מלנומה6. הבנת כיצד החולה המודל הטוב ביותר intratumoral טרוגניות יאפשר לחוקרים לפתח בצורה טובה יותר שיטות טיפוליות שיכולות להרוג אוכלוסיות משנה עמידים לטיפול כי כישלון לתקן הנוכחי של טיפול טיפולים.
פרמאונט לערך ניבוי מוגבל של דגמי קו התא הוא כיצד הם הוקמו בתחילה. שינויים בלתי הפיכה להתרחש בנוף שבטיים הגידול כאשר השעיה תא יחיד של הגידול של החולים גדל על דו מימדי, רקמה פלסטית כלי התרבות, כולל שינויים בפוטנציאל מתרבים ופולשני, חיסול של ספציפי אוכלוסיות משנה, ושינוי של מידע גנטי7. Xenografts לתוך עכברים אלה קו מלנומה תא מודלים לייצג את הנפוץ ביותר בפלטפורמת vivo עבור מחקרים קדם קלינית; עם זאת, אסטרטגיה זו גם סובלת לכידה המסכן של גידול מורכב טרוגניות נצפתה קלינית. כדי להתגבר על זה מגיע, יש כבר עניין גדל והולך שילוב מודלים פרה מתוחכמים יותר של מלנומה, כולל מודל pdx. PDX מודלים כבר מנוצל עבור > 30 שנים, עם מחקרים הזרע בחולי סרטן ריאות הפגינו הקונקורדנציה בין התגובה של המטופלים לסוכני ציטוטוקסיים ואת התגובה של מודל PDX נגזר מאותו מטופל8. לאחרונה, יש כבר כונן להשתמש במודלים PDX ככלי הבחירה לחקירות קדם קלינית הן בתעשייה והן במרכזים אקדמיים. PDX מודלים, בגלל לכידה מעולה שלהם של טרוגניות הגידול בחולים אנושיים, הם רלוונטיים יותר קלינית לשימוש במאמצי אופטימיזציה טיפול מאשר קו התאים xenografts תלי9. ב מלנומה, יש מכשולים עצומים כי בוטה הניהול הטיפולית של מחלה מתקדמת10. מודלים קלינית רלוונטיים pdx שימשו למודל עמידות קלינית לזהות אסטרטגיות טיפוליות עם סוכנים זמינים קלינית לטיפול בגידולים עמידים בפני11,12. בקצרה, הפרוטוקול המוצג כאן כדי ליצור מודלים PDX דורש השרטת תת עורית של רקמה טרייה של מלנומה הראשי או גרורתי (שנאסף על ידי ביופסיה או ניתוח) לתוך בנוד/scid/IL2-לקולטן null (NSG) עכברים. וריאציות שונות בגישה מתודולוגי משמשות קבוצות שונות; עם זאת, ליבת יסוד קיימת13.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו במסמך זה תיאר הפקת מודלים PDX של מלנומה עם רקמת החולה נגזר גידולים ראשוניים וגרורתי, ביופסיות ליבה, ו FNAs. כאשר העפילו ישירות לתוך עכברי NSG, הגידולים מציגים את המאפיינים המיורפולוגיים הדומים, גנומית ותכונות ביולוגיים לאלה שנצפו בחולה. במקרה כאשר רק כמות קטנה של רקמות זמין לחוקרים, כפי ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למכון החיות של מכון וויסטאר, למתקן המיקרוסקופיה, למתקן היסטולטכנולוגי ולמרכז לאספקת מחקר. מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענקים U54 (CA224070-01), נבג (CA174523), P01 (CA114046-07), ד ר מרים ושלדון ג. אדלסון הקרן למחקר רפואי, ואת קרן המחקר מלנומה.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
