Ein Verfahren wird vorgestellt, um Proteinkinase-A-Aktivitäten in kopffesten, sich verhaltenden Mäusen zu visualisieren. Ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter, tAKAR, wird in kortikalen Neuronen ausgedrückt und für die Bildgebung durch ein Schädelfenster zugänglich gemacht. Die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Bildmikroskopie wird verwendet, um PKA-Aktivitäten in vivo während der erzwungenen Fortbewegung zu visualisieren.
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Methodenartikel
Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neuromodulation übt starke Kontrolle über die Gehirnfunktion aus. Dysfunktion der neuromodulatorischen Systeme führt zu neurologischen und psychiatrischen Störungen. Trotz ihrer Bedeutung, Technologien für die Verfolgung neuromodulatorischen Ereignisse mit zellulärer Auflösung sind gerade erst beginnen zu entstehen. Neuromodulatoren, wie Dopamin, Noradrenalin, Acetylcholin und Serotonin, lösen intrazelluläre Signalereignisse über ihre jeweiligen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren aus, um neuronale Erregbarkeit, synaptische Kommunikation und andere neuronale Funktionen, wodurch die Informationsverarbeitung im neuronalen Netzwerk reguliert wird. Die oben genannten Neuromodulatoren konvergieren auf den cAMP/Proteinkinase A (PKA) Weg. Daher wurde die in vivo PKA-Bildgebung mit einzelzelliger Auflösung als Auslese für neuromodulatorische Ereignisse in einer Art und Weise entwickelt, die der Kalzium-Bildgebung für neuronale elektrische Aktivitäten entspricht. Hierbei wird eine Methode zur Visualisierung der PKA-Aktivität auf der Ebene einzelner Neuronen im Kortex von kopffixierten Benehmen von Mäusen vorgestellt. Dazu kommt ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter (AKAR), genannt tAKAR, zum Einsatz, der auf der Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) basiert. Dieser genetisch kodierte PKA-Sensor wird über die Utero-Elektroporation (IUE) von DNA-Plasmiden oder die stereotaxic-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) in den motorischen Kortex eingeführt. FRET-Änderungen werden mit der zweiphotonenfluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (2pFLIM) dargestellt, die Vorteile gegenüber ratiometrischen FRET-Messungen zur Quantifizierung des FRET-Signals im lichtstreuenden Hirngewebe bietet. Um PKA-Aktivitäten während der erzwungenen Fortbewegung zu untersuchen, wird tAKAR durch ein chronisches Schädelfenster über dem Kortex von wachen, kopffixierten Mäusen abgebildet, die auf einem geschwindigkeitsgesteuerten motorisierten Laufband laufen oder ruhen. Dieser bildgebende Ansatz wird auf viele andere Hirnregionen anwendbar sein, um entsprechende verhaltensinduzierte PKA-Aktivitäten zu untersuchen, und auf andere FLIM-basierte Sensoren für die In-vivo-Bildgebung.
Einleitung
Neuromodulation, auch bekannt als langsame synaptische Übertragung, erzwingt eine starke Kontrolle über die Gehirnfunktion während verschiedener Verhaltenszustände, wie Stress, Erregung, Aufmerksamkeit, und Fortbewegung1,2,3, 4. Trotz seiner Bedeutung steckt die Untersuchung, wann und wo neuromodulatorische Ereignisse stattfinden, noch in den Kinderschuhen. Neuromodulatoren, einschließlich Acetylcholin, Dopamin, Noradrenalin, Serotonin und viele Neuropeptide, aktivieren G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die wiederum intrazelluläre zwe....
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Protokoll
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Oregon Health and Science University genehmigt.
1. 2pFLIM Mikroskop-Setup
- Installieren Sie ein Photonen-Timing-Zählmodul (PTCM, Materialtabelle) und verbinden Sie sich gemäß herstellerhandbuch mit dem Computer (Abbildung 1).
HINWEIS: Das PTCM ist in der Regel eine Computerplatine, die einen "Sync"-Eingang für das Laserpuls-Timing und einen Photoneneingang aus dem Photomultiplier-Rohr (PMT) erhält. Es empfängt auch Takt-Timing für Pixel, Linien und Frames, von Zwei-Ph....
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Ergebnisse
FRET-FLIM-Sensoren ermöglichen die Visualisierung vieler verschiedener Signalwege, einschließlich des cAMP/PKA-Signalwegs, der an der Neuromodulation beteiligt ist. Das aktuelle Protokoll nutzt den kürzlich entwickelten tAKAR-Sensor in Kombination mit 2pFLIM, um PKA-Aktivitäten bei kopffesten Benahmemäusen zu visualisieren. Die meisten vorhandenen Zwei-Photonen-Mikroskope können mit 2pFLIM-Fähigkeiten aufgerüstet werden, indem drei zu vier Komponenten hinzugefügt werden, wie in
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Diskussion
Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des FRET-FLIM-Sensors tAKAR, um neuromodulationsgesteuerte PKA-Aktivität bei kopffixierten Verhaltensmäusen zu visualisieren. Diese Anwendung basiert auf umfangreichen Tests und Charakterisierungen von tAKAR in vitro und in vivo, um zu zeigen, dass das erhaltene FLIM-Signal für physiologische neuromodulatorische Ereignisse relevant ist17. Hier wird eine In-vivo-Anwendung, die bewegungsinduzierte PKA-Aktivität im motorischen Kortex, verwendet, um die Ver.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Frau Tess J. Lameyer, Frau Ruth Frank und Dr. Michael A. Muniak für die Bearbeitungen und Kommentare und Dr. Ryohei Yasuda von Max Planck Florida für 2pFLIM Akquisitionssoftware. Diese Arbeit wurde unterstützt durch zwei BRAIN Initiative Auszeichnungen U01NS094247 (H.Z. und T.M.) und R01NS104944 (H.Z. und T.M.), ein R01 Stipendium R01NS081071 (T.M.) und ein R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle Auszeichnungen stammen vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, USA.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m Spritzenvorsatzfilter aus Celluloseacetat | Nalgene | 190-2520 | Schritt 3.2.2. |
| 16x 0,8 NA Wasser-Immersionsobjektiv | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-poliges Kabel | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Schritt 2.5. Zum Anschluss des Rotationssensors an den Datenerfassungseingang des Mikroskops |
| Aluminium-Brotbrett | Thorlabs | MB1012 | Schritt 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB Software | N/A | N/A | Schritt 2.5 und Abschnitte 5 - 6. Wird auf Anfrage dem Hauptautor zur Verfügung gestellt |
| Bandpass-Barrierefilter | Chroma | ET500-40m | Schritt 1.4. |
| Käfigplatte | Thorlabs | CP01 | Schritt 2.4. Wird als Halterung für Rotationssensor verwendet |
| Kohlenstoffstahlfräser für Mikrobohrer, 0,5 mm Spitzendurchmesser | FST | 19007-05 | Schritte 3.2.3. und 4.4. |
| Zirkuläres Deckglas (5 mm Durchmesser) | VWR | 101413-528 | Stufe 4.5. |
| Maßgeschneiderter Injektionsnadelhalter | N/A | N/A | Schritt 3.2.4. Technische Details, die auf Anfrage dem Hauptautor zur Verfügung gestellt werden: |
| Dentalacryl | Yates Motloid | 44114 | Schritte 4.3. und 4.5. |
| Zahnbohrer; Microtorque ii | Ram Produkte | 66699 | Schritte 3.2.3. und 4.4. |
| Dowsil transparentes Polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Schritt 4.5. Künstliche Dura |
| Elektroporationselektrode | Bex | LF650P5 | Schritt 3.1.4. |
| Elektroporator | Bex | CUY21 | Schritt 3.1.4. |
| Schnell grün FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Schritt 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB Software | N/A | N/A | Abschnitt 5. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB-Software | N/A | N/A | Abschnitte 5. und 6. Wird auf Anfrage dem Hauptautor zur Verfügung gestellt |
| Schaumverträglicher Kleber (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Schritt 2.3. |
| Kopfplatte | N/A | N/A | Schritt 4.3. Technische Details werden auf Anfrage dem Hauptautor zur Verfügung gestellt |
| Kopfplattenhalter | N/A | N/A | Schritt 2.6. Technische Details auf Anfrage Hauptautor, verwendet in Kombination mit Montagepfostenhalterung und rechtwinkliger |
| Halterung Hydraulischer Mikromanipulator | Narishige | MO-10 | Schritt 3.2.4. |
| Krazy Kleber | Krazy Kleber | KG82648R | Schritt 4.3. Kleber auf Cyanacrylat-Basis |
| Geräuscharme schnelle Photomultiplier-Röhre | Hamamatsu | H7422PA-40 oder H10769PA-40 | Schritt 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Schritte 2.6 und Abschnitte 5 und 6. Wird verwendet, um die Mikroskoperfassungs- und Datenanalysesoftware |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Schritt 2.4 auszuführen. |
| Motordrehzahlregler | Elenker | EK-G00015A1-1 | Stufe 2.5. |
| Motorisierter Mikromanipulator | Sutter | MP-285 | Schritt 3.2.4. |
| Montagesockel | Thorlabs | BA1S | Stufe 2.5. Wird für Stifte für Motor und Sensor in Kombination mit PH4 und TR2 |
| Montagepfosten | Thorlabs | P14 | Step 2.6 verwendet. Wird für den Kopfplattenhalterpfosten in Kombination mit PB2 |
| Montagepfostenbasis | Thorlabs | PB2 | Step 2.6 verwendet. Wird für den Kopfplattenhalterpfosten in Kombination mit der P14 |
| Montagepfostenhalterung | Thorlabs | C1515 | Step 2.6 verwendet. Wird in Kombination mit dem rechtwinkligen Bügel und dem Kopfplattenhalter |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5 verwendet. Wird für Stifte für Motor und Sensor in Kombination mit BA1S und PH4 |
| Phosphatgepufferter Kochsalzlösung | verwendetΝ/Α | Ν/Α | Schritt 3.2.2. Protokoll: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs FDS010 | Schritt 1.2. | |
| Photonen-Timing-Zählmodul | Becker und Hickl | SPC-150 | Schritt 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Schritt 3.1.3. |
| Pfostenhalter | Thorlabs | PH4 | Schritt 2.5. Wird für Pfosten für Motor und Sensor in Kombination mit BA1S und TR2 |
| Rechtwinkliger Winkel | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Wird in Kombination mit Montagepfostenhalter und Kopfplattenhalter |
| verwendet Rotationsgeber | US digital | MA3-A10-250-N | Schritt 2.4. |
| Gummimatte | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Stufe 2.1. |
| Wellenkupplung (1/4 Zoll x 1/4 Zoll) | McMaster | 6208K433 | Schritte 2.3. und 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Schritte 5.9. und 6.1. |
| Signalsplitter | Becker und Hickl | HPM-CON-02 | Schritt 1.3.1. |
| Edelstahlachse (Durchmesser 1/4 Zoll, L = 12 Zoll) | McMaster | 1327K66 | Stufe 2.3. |
| Stereotaktisches Ausrichtungssystem | David Kopf | 1900 | Schritte 3.2. und 4.1. modifiziert; Sutter-Mikromanipulator, maßgefertigter Injektionsnadelhalter, hydraulischer Mikromanipulator |
| Zwei-Photonen-Mikroskop | N/A | N/A | Sektion 5. Basierend auf dem modularen In-vivo-Multiphotonenmikroskopiesystem (MIMMS) des HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond Gewebekleber | 3M | 14006 | Schritt 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Schritt 3.2.2. |
| Weiße PE-Schaumstoffrolle (8 Zoll x 12 Zoll) | Fabrication Enterprises INC. | 30-2261 | Schritt 2.1.1. |
| Weißes Polystyrol für Kugelhälften | GrahamSweet | 200mm Durchmesser 2 Hohlhälften | Schritt 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Schritt 4.3. Beschleuniger zum Härten |
Referenzen
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sa....
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Nachdrucke und Genehmigungen
