Summary
Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.
Abstract
Nós apresentamos uma aproximação cytometric do do fluxo para analisar ROS mitochondrial na vária medula viva (BM)-populações derivadas da pilha da haste e do progenitor dos ratos saudáveis assim como ratos com AML conduzido por MLL-AF9. Especificamente, nós descrevemos um processo de coloração da pilha de duas etapas, por meio de que as pilhas saudáveis ou da leucemia BM são manchadas primeiramente com um corante cromogênicos fluorogênicos que detecte superóxidos mitochondrial, seguidos manchando com os anticorpos monoclonais fluorochrome-lig que são usados para distinguir várias populações hematopoiéticas saudáveis e malignas do progenitor. Também fornecemos uma estratégia para a aquisição e análise das amostras por citometria de fluxo. Todo o protocolo pode ser realizado em um prazo tão curto quanto 3-4 h. Destacamos, também, as principais variáveis a serem consideradas, bem como as vantagens e limitações do monitoramento da produção de Eros no compartimento mitocondrial de subpopulações hematopoiéticas e de leucemia de tronco e progenitoras ao vivo, utilizando corantes fluorogênicos por citometria de fluxo . Além disso, nós apresentamos dados que a abundância mitochondrial dos Ros varia entre subpopulações saudáveis distintas do hspc e progenitores da leucemia e discutimos as aplicações possíveis desta técnica na pesquisa hematológicas.
Introduction
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas altamente reativas derivadas de oxigênio molecular. A localização celular mais bem definida da produção de Eros é a mitocôndria, onde elétrons que passam pela cadeia de transporte de elétrons (ETC) durante a fosforilação oxidativa (OXPHOS) são absorvidos por oxigênio molecular, levando à formação de um específico tipo de ROS denominados superóxidos1. Através das ações de uma série de enzimas, chamadas superóxido superóxido ou Sods, os superóxidos são convertidos em peróxidos de hidrogênio, que são posteriormente neutralizados em água por enzimas como catalase ou glutationa peroxidases (GPX). Perturbações nos mecanismos de regulamentação de ROS podem levar ao excesso de produção de Eros, muitas vezes referido como estresse oxidativo, que têm conseqüências celulares prejudiciais e potencialmente letais, como danos de macromoléculas (ou seja, DNA, proteínas, lipídios). Além disso, o estresse oxidativo está relacionado a diversas patologias, como diabetes, doenças inflamatórias, envelhecimento e tumores2,3,4. Para manter a homeostase redox e prevenir o estresse oxidativo, as células possuem uma variedade de mecanismos de regulação de ROS5.
Os níveis fisiológicos de certas Eros são necessários para a hematopoiese embrionária e adulta adequada6. No entanto, o excesso de Eros está associado a danos no DNA, diferenciação celular e exaustão da haste hematopoiética e do grupo progenitor. Há também evidências de que alterações na biologia redox podem diferir entre leucemia e células saudáveis. Por exemplo, os níveis de Ros tendem a ser mais elevados em células de leucemia mielóide aguda (AML) em relação aos seus homólogos saudáveis e outros estudos sugeriram que as células-tronco de leucemia mantêm um baixo nível de estado estacionário de Ros para a sobrevivência7,8. É importante ressaltar que as estratégias para capitalizar terapeuticamente nessas diferenças redox mostraram-se promissora em váriasconfigurações de câncerhumano9,10. Portanto, os ensaios que permitem a avaliação dos níveis de Eros em modelos de camundongo podem melhorar nossa compreensão de como essas espécies contribuem para a fisiologia celular e a patogênese da doença, bem como potencialmente fornecem uma plataforma para avaliar a eficácia da novo redox-visando terapias anti-câncer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no Fox Chase Cancer Center.
Nota: O fluxo de trabalho do protocolo é dividido em 4 partes conforme apresentado na Figura 1 e os reagentes necessários estão listados na tabela de materiais.
1. isolação da medula óssea (BM)
Nota: Os ratos da leucemia de MLL-AF9 foram gerados como descrito previamente11.
- Recupere pilhas mono-nucleares da medula, como descrito previamente12,13,14,15, do tipo selvagem camundongos C57. Bl6 (que expressam o marcador do CD 45,2 congênicos) assim como de C57. Camundongos Bl6-SJL (que expressam o marcador congênico CD-m) que foram transplantados com células de leucemia expressando MLL-AF9 (CD 45,2+).
Nota: O BM pode ser recuperado dos ratos ou esmagando12,13 ou nivelando os ossos14,15. Para os experimentos aqui apresentados, a BM foi recuperada de camundongos saudáveis e de leucemia via rubor.
2. coloração de corante Fluorogênico de ROS mitocondrial
- Uma vez que as pilhas mono-nucleares da medula foram recuperadas dos ratos saudáveis e/ou da leucemia, manchar uma alíquota das pilhas com azul de trypan e contar usando um hemocitômetro para determinar o número começar de pilhas totais do BM.
- Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min. aspirar o sobrenadante e ressuscitem o pellet em F-PBS (PBS suplementado com 2% soro fetal bovino e um 1% penicilina/estreptomicina cocktail) para uma concentração de 2 x 106 células/ml.
- Alíquota 200 μL de suspensão celular por tubo em 9 tubos de controlo de cor única rotulados da seguinte forma:
Nenhuma mancha, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (para HSPCs saudável somente), CD 45,2-APC (para pilhas da leucemia somente), CD34-FITC, tintura mitochondrial dos ROS e mancha viva/inoperante da pilha.
Nota: Opcional Um controle positivo para a indução de ROS mitochondrial pode ser preparado tratando 2 x 105 pilhas em 200 μl com 20 ΜM do bissulfito de sódio do Menadione (MSB) para 1 h em 37 ° c em uma incubadora de 5% co2 . Um segundo controle para inverter a indução mediada por MSB de ROS mitochondrial pode ser preparado tratando 2 x 105 pilhas em 200 μl com 20 ΜM de MSB mais 100 μm N-acetil-L-cisteína (NAC) para 1 h em 37 ° c em uma incubadora de 5% co2 . - Aliquot as pilhas restantes em um tubo (tubo experimental) e Centrifugue em 300 x g por 5 minutos.
- Resuspend as pilhas em F-PBS com uma mancha viva/inoperante da pilha de acordo com as instruções do fabricante. Incubar no gelo por 30 min. Certifique-se de adicionar a mancha viva/inoperante ao tubo de controle da único-cor.
- Adicionar 1,0 mL de temperatura ambiente (RT) F-PBS para ambos os tubos de cor única e experimental manchado com o corante vivo/morto. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.
- Resuspend 50 μg do corante mitocondrial de ROS em 13 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) para obter uma solução de estoque de 5 mM.
- Diluir a tintura mitocondrial de ROS para uma concentração final de 5 μM em RT F-PBS com ou sem verapamil (50 μM).
- Aspirar fora da lavagem da mancha viva/inoperante da pilha. Adicionar 200 μL de coloração de corante de ROS mitocondrial contendo Verapamil a cada tubo experimental, bem como o tubo de controlo de cor única de corante ROS mitocondrial.
- Vortex para misturar e incubar por 10 min a 37 ° c no escuro.
- Adicione 1,0 mL de RT F-PBS ao controle de cor única e tubos experimentais com coloração de ROS mitocondrial. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.
- Aspirar o sobrenadante e lavar as células com um adicional de 1,0 mL de RT F-PBS. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.
3. coloração do anticorpo da linhagem
- Prepare os coquetéis de anticorpos listados na tabela 1.
Nota: Estescocktails de anticorposforam otimizados anteriormente14,15,16. - Aspirar o sobrenadante da lavagem final de corante ROS mitocondrial dos tubos experimentais contendo BM saudável e adicionar 200 μL de cocktail de anticorpos #1 a cada tubo. Vortex para misturar. Também prepare os tubos de controle de cor única. Incubar por 60 min no gelo no escuro.
- Aspirar o sobrenadante da lavagem final de corante ROS mitocondrial dos tubos experimentais contendo leucemia BM e adicionar 200 μL do coquetel de anticorpos #2 para cada tubo. Vortex para misturar. Incubar por 60 min no gelo no escuro.
- Lave com 1,0 mL de F-PBS frio e Centrifugue 5 min a 300 x g em RT.
- Reressuscita as células em 500 μL de F-PBS a frio e filtre as células em um tubo de citometro de fluxo usando um filtro de 40 μm para excluir agregados.
4. aquisição e análise de citometria de fluxo
Nota: Diversos subconjuntos hematopoietic da haste e do progenitor são raros, tais como pilhas de haste hematopoietic a longo prazo. Assim, idealmente 3-5 milhões de eventos devem ser coletados para cada tubo experimental durante a aquisição de citometria de fluxo para análise suficiente de ROS mitocondriais nos vários subconjuntos de HSPC.
- Use o tubo de controle sem mancha para definir as parcelas de dispersão para frente (FSC-A) e lateral (SSC-A) com base no tamanho e na complexidade da população de células analisada.
- Use os tubos de controle da nenhum-mancha e da único-cor para compensar o cytometer do fluxo.
- Portão fora detritos estranhos do gráfico de dispersão para a frente e lateral (Figura 2a, B, primeiro painel da esquerda).
- Porta para fora doublets usando um discriminador duplo, como o discriminador para a frente (Figura 2a, B, segundo painel da esquerda).
- Siga a estratégia de gating proposta na Figura 2a,B para selecionar células ao vivo, linhagem células baixas e os vários subconjuntos hspc e leucemia.
- Para cada população de interesse, analisar a intensidade de fluorescência mediana (MFI) do canal TRPE (eixo x) em um gráfico de histograma para avaliar as diferenças no sinal de ROS mitocondrial (Figura 3a-C, painéis esquerdos). Os níveis de ROS mitochondrial podem ser avaliados a nível da único-pilha comparando ROS mitochondrial que mancham contra marcadores específicos da linhagem em um gráfico de dispersão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Apresentado é um método para análise de ROS nas mitocôndrias de múltiplas populações de progenitoras de leucemia, saudáveis e MLL-AF9. A Figura 1 exibe uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo, que consiste em 4 etapas principais: 1) isolamento BM de camundongos; 2) coloração das células BM com corante fluorogênico que reconhece ROS mitocondrial, particularmente superóxidos; 3) mancha do anticorpo do marcador de superfície para delinear várias populações hematopoiéticas saudáveis e da leucemia; e 4) aquisição e análise de citometria de fluxo.
Figura 2 A, B retrata uma estratégia de gating representativa para analisar as várias populações hematopoietic da haste e do progenitor no BM saudável e da leucemia. Um gráfico FSC/SSC é aplicado para eliminar detritos e um gráfico FSC-Area (FSC-A) versus FSC-Height (FSC-H) é usado para excluir doublets e agregados. Um painel de marcadores de superfície da linhagem (tabela 1 e etapa 3,1) é combinado para excluir uma variedade de populações hematopoiéticas maduras, como linfócitos, eritrócitos, granulócitos e monócitos/macrófagos (ou seja, linhagem baixa ou Linbaixa). O coquetel de linhagem também inclui um anticorpo CD48 e, portanto, todos os subconjuntos de células de linhagem baixa também são CD48-. A expressão da superfície celular SCA-1 e c-kit é usada para distinguir uma mistura heterogênea de HSPCs chamada CD48- lsks (LinLow, SCA-1+, c-kit+, CD48-) de progenitores mielóides (LinLow, SCA-1- , c-kit+, CD48-). Para distinguir ainda vários subconjuntos hspc, o marcador Slam, CD150, bem como CD34 também são adicionados17,18,19,20,21. Figura 2 B também retrata uma estratégia de gating representativa para os progenitores de leucemia de alta expressão de ckit (Linbaixo, c-kitHigh; SCA-1-), que são enriquecidos para a leucemia que inicia pilhas (lics)11 as well as as pilhas da leucemia que expressam o intermediário-baixa expressão de cKit (int de ckit-baixo).
Uma comparação da coloração mitocondrial de ROS entre os progenitores CD48- LSK e Myeloid saudáveis mostra que os progenitores Myeloid mostram níveis significativamente mais elevados de coloração mitocondrial de Ros (Figura 3A). Além disso, os progenitoreselevados da leucemia de ckit apresentam níveis significativamente mais elevados de coloração MITOCONDRIAL de Ros em comparação com CD48- LSK, progenitores mielóides ou células de leucemia de ckitint-baixa (Figura 3A). cKitint-células de baixa leucemia também apresentaram coloração de Ros mitocondrial significativamente maior em comparação às células CD48- LSK, mas não aos progenitores Mieloides (Figura 3a). LSKs mais subdividido pela expressão CD150 mostrou que a coloração mitocondrial de ROS não variava significativamente em células CD48- LSK SUBDIVIDIDAS por CD150 alta (CD150alta), intermediária (CD150int) ou não (CD150neg) expressão (Figura 3B). No entanto, a coloração de ROS mitocondrial de estado estacionário de cKitalta ou ckitint- células de baixa leucemia foi encontrada para ser significativamente maior do que CD48-lsks-CD150High,-CD150int ou-CD150 célulasneg ( Figura 3B). As pilhas de LSK que expressam baixo a nenhuns níveis de CD34 são enriquecidas para a longo prazo reconstituindo pilhas de haste hematopoietic, particularmente as pilhas CD48-LSK que são CD34- e CD150elevação20,21. Entretanto, a subdivisão das células CD48-LSK pela expressão CD150 e CD34 não revelou diferenças significativas na coloração de ROS mitocondrial entre esses seis subconjuntosde Hspc (Figura 3C).
Figura 1 : Representação esquemática do fluxo de trabalho do protocolo. Etapa 1) isolação do BM dos ratos leucêmicos saudáveis e MLL-AF9; Passo 2) coloração celular usando um corante ROS mitocondrial (mROS); Passo 3) coloração celular com anticorpos monoclonais ligados a fluorocromo para discriminar a população de tronco e células progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) em camundongos saudáveis e leucêmicos; Passo 4) fluxo de citometria de aquisição e análise de ROS mitocondrial em várias populações de HSPC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Citometria de fluxo que gating estratégias para saudável e MLL-AF9-expressando pilhas da medula. (A) as células BM isoladas de camundongos saudáveis foram coradas com corante vivo/morto (qdot), corante de Ros mitocondrial (trpe). O BM dos ratos saudáveis foi manchado subseqüentemente com os anticorpos que reconhecem marcadores da linhagem mais CD48 (Cy5-PE), c-jogo (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) Além da célula viva/morta e das manchas de Ros mitocondrial, a BM de camundongos de leucemia também foi corada com anticorpos reconhecendo marcadores de linhagem mais CD48 (CY5-PE), c-Kit (CY7-APC), Sca1 (pacblue) e CD 45,2 (APC), que é aplicado para discriminar entre as células de leucemia MLL-AF9 de células do receptor saudável BM (CD-do). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Níveis mitocondrial de Ros na medula óssea saudável e MLL-AF9. Os painéis esquerdos são histogramas representativos de níveis de ROS mitocondriais das populações indicadas e os respectivos painéis direito representam análises de gráfico de barras da MFI de ROS mitocondrial para as populações indicadas (n = 4). (A) comparação dos níveis de Ros mitocondrial em saudáveis CD48- LSK, progenitores mielóides, bem como mll-AF9 Linbaixo c-kitalto e mll-AF9 Linbaixo c-kitint-células baixas . (B) comparação dos níveis de Ros mitocondrial em células CD48- LSK saudáveis com base na sua expressão CD150 versus mll-AF9 LinLow c-kitHigh e mll-AF9 LinLow c-kitint-células baixas . (C) comparação dos níveis de Ros mitocondrial em células CD48- LSK saudáveis com base em sua expressão CD150 e CD34. (* p ≤ 0,05; * * p < 0, 1 * * * p < 0, 1; * * * * p < 0, 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Alterações nos níveis de Ros mitocondrial usando compostos pró-oxidantes e antioxidantes. Histogramas de níveis de ROS mitocondriais em células saudáveis e MLL-AF9-expressando BM tratadas com 20 μM de bissulfito de sódio de menadiona (MSB) por 1 h a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 (controle positivo) ou com 20 ΜM de MSB em combinação com 100 μm N-acetil-L-cisteína (NAC) para 1 h a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Otimização do Ros mitocondrial e manchas de anticorpos que reconhecem a linhagem. (A) comparação dos níveis de Ros mitocondrial (MROs) em mll-AF9 expressando células de leucemia usando 1 ou 5 μm para 10 ou 30 min. (vermelho = veículo; Azul = MSB 20 μM; Verde = NAC 100 μM; Laranja = MSB 20 μM + NAC 100 μM). (B) comparação da MFI do canal CD34 (FITC) em lsks saudáveis corados por 20, 60 ou 90 min com o coquetel de anticorpos #1 (n = 4, * p ≤ 0, 5; * * p < 0, 1). (C) comparação dos anticorpos que mancham antes ou depois da incubação por 30 min a 37 ° c em uma incubadora de 5% co2 . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Ordem de Ros mitocondrial e coloração do anticorpo marcador de linhagem. (A) parcelas de pontos das populações de HSPCs indicadas, obtidas por meio de diferentes ordens de coloração. (B) os níveis de Ros mitocondrial avaliados nos compartimentos LSK e progenitores mielóides obtidos utilizaram diferentes ordens de coloração (vermelho = anticorpo de coloração por 1 h a 4 ° c seguido de coloração mitocondrial por 10 min a 37 ° c; Azul = coloração de ROS mitocondrial por 10 min a 37 ° c seguida de anticorpos que colorem 1h a 4 ° c). (C) quantificação da MFI de coloração de Ros mitocondrial (MROs) utilizando diferentes ordens de coloração nas populações indicadas (n = 4, * p ≤ 0, 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Impacto do tratamento do Verapamil na mancha mitochondrial da tintura de Ros em pilhas saudáveis e MLL-AF9-expressando de BM. (A) parcelas de pontos das populações de hspc indicadas em amostras tratadas com ou sem 50 ΜM de Verapamil por 10 min a 37 ° c em uma incubadora de 5% co2 . (B) HISTOGRAMAS de Ros mitocondrial e coloração de mitoMASS corante verde nas populações de hspc indicadas na presença (azul) ou ausência (vermelho) de 50 ΜM de Verapamil. (C-E) Quantificação dos níveis de ROS mitocondriais nas populações de células saudáveis (C & D) e leucemia (E) indicadas em amostras de BM tratadas com ou sem 50 μM de Verapamil durante coloração de ROS mitocondrial (n = 4, * p ≤ 0, 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: cocktails de anticorpos. Lista de coquetéis de anticorpos preparados na etapa 3,1. identificar várias subpopulações hematopoiéticas dentro da medula óssea saudável e da leucemia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Corantes fluorogênicos que foram desenvolvidos para a detecção de Eros são freqüentemente avaliados em células fixas por microscopia ou em células ao vivo por citometria de fluxo22. A avaliação citométrica do fluxo de Ros mitochondrial em pilhas de BM usando tinturas cromogênicos fluorogênicos mitocondrial dos Ros tem duas vantagens principais: 1) é uma técnica rápida e simples que seja apropriada para a análise viva da pilha e 2) permite distinguir e analisar raro populações no nível de célula única no BM utilizando coloração de marcador de superfície. O protocolo passo a passo apresentado aqui foi desenvolvido para estudar o status redox ex vivo de populações de tronco e progenitoras hematopoiéticas de ambos os camundongos saudáveis, bem como um modelo de CAMUNDONGO de AML conduzido por mll-AF9 usando citometria de fluxo. Existem várias variáveis técnicas importantes que precisam ser consideradas durante a execução deste protocolo.
Primeiramente, o uso de controles pró-oxidantes e antioxidantes permite ao usuário estabelecer uma linha de base para aumentos na coloração mitocondrial de ROS, bem como a especificidade da mancha. Para o protocolo apresentado, a MSB pró-oxidante foi utilizada como um controle positivo para uma indução detectável de coloração mitocondrial de ROS em células de BM saudáveis e leucemias (Figura 4). O anti-oxidante NAC pode ser usado como um controle adicional, porque reverte pela maior parte a coloração mitochondrial dos ROS induzida por MSB (Figura 4).
Em segundo lugar, a tintura fluorogênica de ROS mitocondrial empregada neste estudo é recomendada para ser utilizada em uma concentração de 5 μM por 10 min. No entanto, o fabricante também sugere que a concentração e o tempo de coloração podem variar entre os tipos de células. Neste estudo, a coloração mitocondrial de ROS foi comparada em 1 μM e 5 μM por 10 ou 30 min. A análise revelou que uma concentração de 5 μM para 10 a 30 minutos é suficiente para detectar alterações mediadas pelo MSB em ROS mitocondriais, bem como aqueles revertidos pelo tratamento NAC (Figura 5a). Como não houve diferença quantitativa entre 10 e 30 min, foi selecionado um tempo de coloração de 10 min para minimizar o comprimento do ensaio.
Em terceiro lugar, os tempos de incubação do anticorpo CD34 variam na literatura de 20 a 90 min23,24. Para otimizar o protocolo aqui apresentado, as células da medula óssea Murina foram incubadas com o coquetel de anticorpos #1 (Step 3,1) por 20, 60 ou 90 min. Como mostrado na Figura 5b, a coloração CD34 significativamente mais forte foi observada nas células coradas por 60 ou 90 min em comparação com a mancha de 20 min. Entretanto, uma diferença significativa na mancha de CD34 não foi observada entre épocas da incubação do anticorpo de 60 e de 90 minutos (Figura 5b) e assim uma mancha do anticorpo de 60 minutos é recomendada para o protocolo apresentado.
Quarto, no protocolo apresentado, as pilhas saudáveis e da leucemia são manchadas primeiramente com o corante cromogênicos fluorogênicos mitocondrial dos Ros, lavado e manchado então com os anticorpos fluorochrome-lig da linhagem. Embora uma avaliação direta de combinar a mancha mitocondrial de ROS com anticorpos da linhagem não fosse conduzida neste estudo, uma avaliação da mancha fluorochrome-lig do anticorpo da linhagem foi ensaiada as condições mitochondrial da mancha de ROS para 10, 20 e 30 min a 37 ° c. Esta análise revelou que 30 min de incubação a 37 ° c altera substancialmente a coloração do marcador de superfície da linhagem (Figura 5C). Adicionalmente, a coloração mitocondrial de Ros foi avaliada primeiramente, manchando pilhas saudáveis do BM com os anticorpos fluorochrome-lig da linhagem seguidos manchando com a tintura cromogênicos fluorogênicos mitocondrial dos Ros assim como a ordem vice versa das operações. As células de coloração primeiramente com anticorpos da linhagem seguiram pela coloração mitocondrial de ROS conduziram a uns sinais mitochondrial mais baixos dos ROS comparados ao protocolo de coloração vice versa (figura 6A, B)-incluindo diferenças significativas para CD48- LSK CD150alta, CD48- LSK CD150int CD34 e populações de progenitoras mielóides (Figura 6C).
Quinto, os estudos recentes mostram que as populações saudáveis murino diferentes do hspc possuem habilidades distintas para efluxo diversas pontas de prova cromogênicos fluorogênicos da mancha mitochondrial tais como aquelas usadas para avaliar a massa mitochondrial (adiante referida como o verde de mitomass) ou potencial25,26. Conseqüentemente, o impacto do Verapamil do inibidor da bomba do efluxo na mancha de progenitores saudáveis e da leucemia com o corante cromogênicos fluorogênicos mitocondrial de Ros foi avaliado igualmente. A coloração simultânea de HSPCs com ROS mitochondrial não alterou a mancha do anticorpo do marcador da linhagem (Figura 7a), entretanto, o verapamil melhorou significativamente os sinais de coloração mitocondrial de Ros em uma variedade de saudável e a leucemia populações progenitoras (Figura 7b, C). Notavelmente, a magnitude da melhora da coloração mitocondrial de ROS por Verapamil não foi tão grande como a observada com o corante fluorogênico verde mitoMASS (Figura 7B).
Sexto, no protocolo aqui apresentado, as células da BM foram recuperadas removendo-se as pontas ósseas (epífise) seguidas pelo rubor dos ossos. No entanto, a epífise contém células hematopoiéticas que potencialmente podem ser perdidas por rubor ósseo. Como alternativa, as células BM podem ser extraídas por esmagou ossos com um almofariz e pilão como descrito anteriormente12,13.
O protocolo aqui apresentado fornece uma base para o uso de corantes fluorogênicos para medir a biologia redox intracelular em células vivas extraídas de organismos vivos. No entanto, é importante notar que nenhum corante fluorogênico único pode ser considerado definitivamente específico e, portanto, estudos adicionais com métodos alternativos devem ser conduzidos para verificar quaisquer achados. Além disso, os resultados deste estudo sugerem que as populações da pilha da leucemia enriquecidas para LICs (isto é, Linbaixo ckitelevado) indicam uns níveis mais elevados de Ros mitochondrial do que progenitores Myeloid saudáveis ou outras populações do hspc. No entanto, a população de células de leucemia dealta ckit Linbaixa avaliada aqui demonstrou ser heterogênea e pode ser ainda mais subdividida por outros marcadores de linhagem11,27. Além disso, os estudos recentes mostram que os LICs possuem um phenotype metabólico distinto28. Conseqüentemente, os estudos futuros que avaliam ROS mitochondrial em paralelo com ensaios ou pontas de prova metabólicos assim como anticorpos adicionais do marcador da linhagem serão informativos.
Este protocolo direto permite a medida de níveis mitochondrial de ROS em pilhas hematopoietic vivas e pode fornecer uma base para estudar a biologia redox de pilhas saudáveis e doentes da haste e do progenitor assim como para avaliar a eficácia de terapias de segmentação redox.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Fox Chase Cancer Center Conselho de administração (DDM), a sociedade americana de Hematologia Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) e do departamento de defesa (Award #: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
