Method Article

Menselijke blastocyst biopsie en vitrificatie

DOI:

10.3791/59625

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1G.EN.E.R.A. Centers for Reproductive Medicine, 2DAHFMO, Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blastocyst biopsie en vitrificatie zijn vereist voor het efficiënt uitvoeren van preimplantatie genetische testen. Een aanpak die de sequentiële opening van de zona pellucida en het ophalen van 7-8 trophectoderm cellen in dag 5-7 post-inseminatie beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties en de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blastocyst biopsie wordt uitgevoerd om een betrouwbare genetische diagnose te verkrijgen tijdens IVF-cycli met pre-implantatie genetische testen. De ideale workflow omvat dan een veilig en efficiënt vitrificatie protocol, door de doorlooptijd van de diagnostische technieken en om de geselecteerde embryo (s) over een fysiologisch endometrium over te brengen in een volgende natuurlijke cyclus. Een biopsie benadering die de sequentiële opening van de zona pellucida omvat en het opvragen van 5-10 trophectoderm cellen (idealiter 7-8) beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties als de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities. Na de juiste training, de techniek was reproduceerbaar over verschillende exploitanten in termen van timing van biopsie (~ 8 min, variërend 3-22 min op basis van het aantal embryo's tot biopsie per gerecht), definitieve diagnoses verkregen (~ 97,5%) en levende geboortecijfers na verglaasd-opgewarmde euploïde blastocyst overdracht (> 40%). De overlevingskans na biopsie, vitrificatie en opwarming was zo hoog als 99,8%. De re-expansie snelheid bij 1,5 uur van opwarming van de aarde was zo hoog als 97%, grotendeels afhankelijk van de timing tussen biopsie en vitrificatie (idealiter ≤ 30 min), blastocyst morfologische kwaliteit en de dag van de biopsie. In het algemeen is het beter om een ingeklapte blastocyst te vitrificeren; Daarom kan in niet-PGT-cycli lasergeassisteerde kunstmatige krimp worden uitgevoerd om embryo-instorting voorafgaand aan cryopreservation te induceren. Het meest veelbelovende toekomstperspectief is de niet-invasieve analyse van de IVF-cultuur media na de blastocyst-cultuur als een bron van embryonaal DNA. Deze potentiële avant-garde wordt echter nog steeds onderzocht en een betrouwbaar protocol moet nog worden gedefinieerd en gevalideerd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het belangrijkste doel van de moderne menselijke embryologie is om het aantal levende geboorten per gestimuleerde cyclus te maximaliseren en kosten, tijd en inspanningen om een zwangerschap te bereiken te verminderen. Om dit doel te bereiken, moeten gevalideerde benaderingen voor embryoselectie worden gebruikt om reproductief bevoegde embryo's te identificeren binnen een cohort die tijdens een IVF-cyclus is verkregen. Volgens de laatste bewijzen is blastocyst Culture1 in combinatie met uitgebreide chromosomale testen en verglaasd euploïde embryo transfer (et) het meest efficiënte kader om IVF-efficiëntie2te verhogen. Het....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol voor humane blastocyst biopsie, hier beschreven, volgt de richtlijnen van G. EN. milieurisicobeoordeling van menselijk onderzoek.

Opmerking: Raadpleeg de materiaal tabel voor de benodigde materialen. Verder materiaal nodig omvat laboratorium schoeisel en uitrusting, chirurgische gelaatsmasker, haar deksel, chirurgische handschoenen, een permanente niet-giftige marker, Tang en ontsmettingsmiddel. Het gebruik van chirurgische Gown, wegwerp chirurgische handschoenen, Facemask, haar deksel is verplicht om het risico van besmetting te voorkomen. Alle werkgebieden, evenals de apparatuur die bij het p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 6 vertegenwoordigt een schema van alle uitkomsten van een biopsie procedure die kunnen worden vastgesteld om het protocol te standaardiseren en de prestaties van elke operator te bewaken. De belangrijkste procedurele uitkomst is de timing voor het voltooien van de biopsie/biopsieën; de belangrijkste technische uitkomst is de kwaliteit van het perceel dat wordt geproduceerd na genetische tests die kunnen resulteren in een afdoende of twijfelachtige diag.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alleen goed ervaren, bekwame embryo logen die hun trainingsperiode hebben voltooid, moeten zowel TE biopsie als blastocyst vitrificatie uitvoeren. Bovendien is een getuige vereist om de procedures te monitoren en een efficiënte traceerbaarheid te garanderen tijdens i) de bewegingen van de biopsied blastocyst uit de biopsie schotel (aanvullend figuur 1) naar de post-biopsie schotel (aanvullend figuur 1 ), vervolgens op de vitrificatie plaat (aanvullend figuur 1) en ten sl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AG en RM hebben de gegevens verzameld en het manuscript opgesteld. DC analyseerde de gegevens, stelde de representatieve resultaten voor, voerde de statistieken uit en reviseerde het manuscript. FMU en LR hebben een kritische bespreking van de resultaten en van het hele manuscript gegeven.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Cold tube rackBiocisionXTPCR96
Electronic pipette controllerFisher Scientific710931
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper holder
Gilson PipetmanGilson66003p20
IVF Electronic Witness SystemCooperSurgical Fertility & Genomic SolutionsRI Witness ART Management System
Inverted microscopeNikonEclipse TE2000-U
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Laser objectiveRISaturn 5
MicroinjectorsNikon NarishigeNT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubesEppendorfCSLQSPINfor 0.2 mLl PCR tubes
StereomicroscopeLeicaLeica M80
ThermostatPanasonicMCO-5AC-PE
Tri-gas incubatorPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
Consumables
Biopsy pipetteRI7-71-30FB3572030 µm ID, flat 35 °C
CryolockCryolockCL-R-CT
CSCM completeIrvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer CatheterCookG17934
Flexipet pipetteCookG26712140µm stripping pipette tip
Flexipet pipetteCookG46020300µm stripping pipette tips
Holding pipetteRI7-71-IH35/2030 µm ID, flat 35 °C
Human Serum AlbuminIrvine Scientific9988
IVF One well dishFalcon353653
Mineral Oil for embryo cultureIrvine Scientific9305
Modified HTF MediumIrvine Scientific90126Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta SurfaceThermofisher scientific176740IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dishCorning35380260 mm x15 mm
ReproplateKitazato83016
Serological pipetteFalcon35755110ml
Sterile disposable Gilson tipsEppendorf0030 075.021200 µL
Tubing KitProvided by the genetic labPCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification mediaKitazatoVT801Equilibration and vitrification solutions
Warming mediaKitazatoVT802Thawing and dilution solutions

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118(2016).
  2. Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Blastocyst BiopsyTrophectoderm CellsZona PellucidaVitrification ProtocolPreimplantation Genetic TestingIVF Embryo TransferLaser Assisted BiopsyEmbryo VitrificationCryopreservation SupportGenetic Laboratory Testing

Related Articles