Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

Resumen

Este protocolo utiliza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en sondas en tiempo real, un ensayo de sulforhodamine B (SRB), 3' regiones no traducidas (3' UTR) clonación, y un ensayo de luciferasa para verificar los genes diana de un miRNA de interés y para entender las funciones de los miRNAs.

Resumen

Los MicroRNAs (miRNAs) son pequeños ARN reguladores que se reconocen para modular numerosas vías de señalización intracelular en varias enfermedades, incluidos los cánceres. Estos pequeños ARN reguladores interactúan principalmente con las 3' regiones no traducidas (3' UTR) de sus ARN mensajeros objetivo (RNN) lo que en última instancia resulta en la inhibición de los procesos de decodificación de ARNM y el aumento de las degradaciones de ARNm objetivo. Basados en los niveles de expresión y las funciones intracelulares, los miRNAs son capaces de servir como factores reguladores de los ARNM oncogénicos y supresores tumorales. La identificación de genes diana de buena fe de un miRNA entre cientos o incluso miles de objetivos predicados computacionalmente es un paso crucial para discernir las funciones y los mecanismos moleculares básicos de un miRNA de interés. Varios programas de predicción de objetivos de miRNA están disponibles para buscar posibles interacciones miRNA-mRNA. Sin embargo, la pregunta más difícil es cómo validar los genes diana directos de un miRNA de interés. Este protocolo describe una estrategia reproducible de métodos clave sobre cómo identificar objetivos de miRNA relacionados con la función de un miRNA. Este protocolo presenta una guía práctica sobre los procedimientos paso a paso para descubrir los niveles de miRNA, funciones y ARNM objetivo relacionados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la sonda, el ensayo de sulforhodamine B (SRB) después de una imitación de miRNA en la transfección , la generación de curvas de dosis-respuesta y el ensayo de luciferasa junto con la clonación de 3' UTR de un gen, que es necesario para una comprensión adecuada de las funciones de los miRNAs individuales.

Introducción

Los MicroARN (miRNAs) son los pequeños ARN reguladores que modulan principalmente el proceso de traducción y degradación de los ARN mensajeros (ARN) reaccionando a las 3' regiones no traducidas (3' UTR) en genes diana de buena fe¹. La expresión de los miRNAs puede ser regulada por mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales. El desequilibrio de estos mecanismos reglamentarios aporta niveles de expresión de miRNAs no controlados y distintivos en numerosas enfermedades, incluidos los cánceres^2. Un solo miRNA puede tener múltiples interacciones con diversos ARNm. En consecuencia, un ARNm individual puede ser contr....

Protocolo

1. Análisis de expresión de microARN maduro (miRNA)

1. Síntesis madura de ADN complementario de miRNA (ADNc)
   1. Añadir 254 ng de ARN total y 4,5 l de mezclas de desoxirribonucleasa I (DNase I), y luego añadir agua ultrapura en tubos de tiras PCR para hacer hasta 18 l (Figura2A). Preparar la reacción para cada muestra total de ARN purificada a partir de varias líneas celulares utilizando la cantidad suficiente de mezclas DNase I basadas en el número total de reacciones.
      NOTA: Las mezclas de DNase I se componen de DNase I (1,8 l), inhibidor de ribonucleasa (0,3 l) y 25 mM de MgCl₂

Resultados

La confirmación exitosa y precisa de los niveles de miRNA es importante para la interpretación de los datos mediante los cuales la clasificación de los miRNAs es posible sobre la base de las funciones previstas de los miRNAs en el desarrollo y progresión de una enfermedad. Los niveles de miRNA-107 y miRNA-301 se midieron en tres líneas celulares de páncreas utilizando el PCR cuantitativo basado en sondas. La síntesis de cDNAs de un miRNA específico y un gen de referencia en la misma reacción puede aumentar la reproducibi.......

Discusión

Las estrategias para la determinación de objetivos de miRNA de buena fe con las funciones de un miRNA de interés son indispensables para la comprensión de múltiples funciones de los miRNAs. La identificación de genes diana de miRNA puede ser una guía para interpretar los eventos de señalización celular modulados por los miRNAs en una célula. Una revelación de genes diana funcionalmente importantes de los miRNAs puede proporcionar el conocimiento fundamental para desarrollar una terapia basada en miRNA en el cáncer.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo cónico de 15 mL	SPL Life Sciences	50015
Placa de 24 pocillos	Thermo Scientific	142475
Tubo cónico de 50 mL	SPL Life Sciences	50050
Placa de 6 pocillos	Falcon	353046
6x Colorante de carga de ADN	Real Biotech Corporation	RD006	1 mL
Tira de 8 tapones	Aplicado Biosystems	N8010535	Para la síntesis de ADNc
Tira de 8 tubos	Applied Biosystems	N8010580	Para la síntesis de ADNc
Placa de 96 pocillos	Falcon	353072
Ácido acético	Sigma	A6283-1L	1
L Agarosa A	Bio Basic	D0012	500 g
Fosfatasa alcalina	New England Biolabs	M0290S	10,000 U/mL
de ampicilina	Bio basic Canada Inc	AB0028	25 g
AriaMx 96 tiras de tubo	Agilent Technologies	401493	Para PCR en tiempo real
Sistema de PCR en tiempo real AriaMx	Agilent Technologies	G8830A	amplificación, detección y análisis de datos de qPCR
AsiSI	New England Biolabs	R0630	10.000 unidades/mL
Células CAPAN-1	ATCC	HTB-79
Campana de cultivo celular	Labtech		Modelo: LCB-1203B-A2
Cámaras de recuento con corte en V	Paul Marienfeld	650010	Contador de células
CutSmart tampón New	England Biolabs	B7204S	Concentración 10X
DMEM	Gibco	11965-092	500 mL
Kit de extracción de gel de ADN	Bionics	DN30200	200 prep
Escalera de ADN	NIPPON Genetics EUROPE	MWD1	1 Kb escalera
DNasa I	Invitrogen		18068015 100 unidades
Sistema de ensayo indicador de luciferasa dual	Promega	E1910	100 ensayos
Suero fetal bovino	Gibco	26140-079	500 mL
Células competentes HIT	Real Biotech Corporation (RBC)	RH617	Células competentes
Células HPNE	ATCC	CRL-4023
LB caldo de agar	Bio Basic	SD7003	250 g
Lipofectamine 2000 Invitrogen		11668-027	0,75 mL
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778-075	0,75 mL
Luminómetro	Promega		Modelo: E5311
Tubo de microcentrífuga	Eppendorf	22431021
Lector de microplacas	TECAN		Infinite F50
mimica de control	Ambion	4464058	5 nmol
miRNA-107 mimic	Ambion	4464066	5 nmol
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	50 prep
Mupid-2plus (sistema de electroforesis)	TaKaRa		Modelo: AD110 NotI
	New England Biolabs	R3189	20.000 unidades/mL
Programa explorador de oligonucleótidos	GeneLink		Para el diseño de imprimaciones
Tapas de tiras de tubos ópticos (8x Strip)	Agilent Technologies	401425	Para PCR en tiempo real
Opti-MEM	Gibco	31985-070	500 ml
Células PANC-1	ATCC	CRL-1469
Penicilina/estreptomicina	Gibco	15140-122	100 mL
Tampón fosfato solución salina	Gibco	14040117	1000 mL
Plásmido ADN miniprep S& V kit	Bionics	DN10200	200 preparación
PrimeSTAR GXL ADN POLIMERASA	TaKaRa	R050A	250 unidades
Shaker	TECAN		Plataforma de agitación
Incubadora de agitación	Labtech		Modelo: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software	Systat Software Inc		Para la generación de curvas dosis-respuesta
Sulforhodamina B en polvo	Sigma	S1402-5G	5 g
SYBR mezcla maestra verde	Smobio	TQ12001805401-3	Colorante fluorescente de unión para dsDNA
T4 ADN ligasa	TaKaRa	2011A	25,000 U
Mezcla maestra TaqMan	Applied Biosystems 4324018		200 reacciones, sin AmpErase Ensayo
microARN UNG TaqMan (has-miR-107)	Applied Biosystems	4427975	Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
Ensayo de microARN TaqMan (has-miR-301)ID del	4427975	Applied Biosystems	: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
Kit TaqMan miR RT	Applied Biosystems	4366597	1.000 reacciones
Incubadora Thermo CO2 (BB15)	ThermoFisher Scientific		37 ° C y 5% CO2 incubación
Ácido tricloroacético	Sigma	91228-100G	100 g
Trizma base	Sigma	T4661-100G	100 g
Agua ultrapura	Invitrogen	10977-015	500 mL
Veriti Termociclador de 96 pocillos	Biosystems		aplicados Para la amplificación de ADN (o ADNc)
XhoI	New England Biolabs	R0146	20.000 unidades/mL

de ensayo de