Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

Résumé

Cette approche moléculaire pour déterminer la forme physique bactérienne facilite la détection précise et précise des micro-organismes à l'aide de codes-barres d'ADN génomique uniques qui sont quantifiés par l'intermédiaire du PCR numérique. Le protocole décrit le calcul de l'indice concurrentiel des souches de Salmonella; cependant, la technologie est facilement adaptable aux protocoles exigeant la quantification absolue de n'importe quel organisme génétiquement malléable.

Résumé

Un indice concurrentiel est une méthode courante utilisée pour évaluer la condition physique bactérienne et/ou la virulence. L'utilité de cette approche est illustrée par sa facilité à effectuer et sa capacité à normaliser la condition physique de nombreuses souches à un organisme de type sauvage. La technique est toutefois limitée par les marqueurs phénotypiques disponibles et le nombre de souches qui peuvent être évaluées simultanément, ce qui crée la nécessité d'un grand nombre d'expériences de repli. Parallèlement à un grand nombre d'expériences, les coûts de main-d'œuvre et de matériaux pour quantifier les bactéries à partir de marqueurs phénotypiques ne sont pas négligeables. Pour surmonter ces aspects négatifs tout en conservant les aspects positifs, nous avons développé une approche moléculaire pour quantifier directement les micro-organismes après l'ingénierie des marqueurs génétiques sur les chromosomes bactériens. Unique, 25 paires de base codes-barres d'ADN ont été insérés à un locus inoffensif sur le chromosome des souches sauvages de type et mutant de Salmonella. Des expériences de compétition in vitro ont été réalisées à l'aide d'inocula composées de souches mises en commun. Après la compétition, les nombres absolus de chaque souche ont été quantifiés à l'aide de PCR numérique et les indices concurrentiels pour chaque souche ont été calculés à partir de ces valeurs. Nos données indiquent que cette approche pour quantifier Salmonella est extrêmement sensible, précise et précise pour détecter à la fois des micro-organismes très abondants (haute condition physique) et rares (faible condition physique). En outre, cette technique est facilement adaptable à presque n'importe quel organisme avec des chromosomes capables de modification, ainsi qu'à diverses conceptions expérimentales qui nécessitent une quantification absolue des micro-organismes.

Introduction

L'évaluation de la condition physique et de la virulence des organismes pathogènes est un aspect fondamental de la recherche en microbiologie. Il permet de faire des comparaisons entre les souches ou entre les organismes mutés, ce qui permet aux chercheurs de déterminer l'importance de certains gènes dans des conditions spécifiques. Traditionnellement, l'évaluation de la virulence utilise un modèle animal d'infection à l'aide de différentes souches bactériennes et en observant les résultats de l'animal infecté (p. ex. Dose infectieuse₅₀, Dose létale₅₀, temps de mort, sévérité des symptômes, absence de symptômes, etc.). Cette procédure fo....

Protocole

1. Incorporez des codes-barres d'ADN uniques sur un Plasmide contenant les composants nécessaires à l'échange allélique

REMARQUE: Un nouveau plasmide, nommé pSKAP, avec un nombre de copies élevés et une efficacité de transformation accrue par rapport au plasmide d'échange allélique pKD13 existant a été créé. Cela est décrit dans les étapes 1.1-1.12 (figure 1). Les plasmides finalisés contenant des codes-barres et des composants uniques d'ADN pour l'échange allélique sont disponibles par l'intermédiaire d'un dépôt de plasmide (tableau des matériaux).

1. À l'aide d'un kit ....

Résultats

L'utilisation de cette méthodologie exige que des réactions de contrôle appropriées soient effectuées pour valider la sensibilité et la spécificité de chaque sonde utilisée pour identifier l'ADN cible. Dans cette expérience représentative, nous avons validé huit codes-barres d'ADN uniques avec les huit sondes correspondantes pour identification. Les huit sondes avaient un faible taux de faux positifs dans les réactions de contrôle du CNT et négatives (tableau 3), souligna.......

Discussion

La capacité de quantifier avec précision les microorganismes est d'une importance primordiale pour la recherche en microbiologie, et la capacité d'énumérer des souches uniques d'une population mixte initiale s'est avérée être un outil inestimable pour évaluer les traits de forme physique et de virulence dans bactérie. Cependant, les techniques pour y parvenir n'ont pas progressé dans le rythme des développements modernes en biologie moléculaire. La technologie pour modifier facilement les chromosomes de nombreuses bactér.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	Eppendorf	22600028	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant Tubes de
culture de 16 mL	MidSci	8599	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
5-200 &mu ; L pointes de pipette	RAININ	30389241	Procurez-vous des marques alternatives d’embouts avec prudence sur la base de la qualité de fabrication
5-50 &mu ; L Pipette multicanaux	RAININ	17013804	Utilisez avec prudence d’autres pipettes multicanaux
Agarose	ThermoFisher Scientific	BP160-500	Procurez-vous auprès de n’importe quel fabricant
BLAST Analysis	NCBI	N/A	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycleur avec module de réaction à 96 puits profonds	Bio Rad	1851197	Il faut se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
Chimiquement compétent DH5&alpha ;	Invitrogen	18258012	Procurez-vous auprès de n’importe quel fabricant ou préparez-vous
Chloramphénicol	ThermoFisher Scientific	BP904-100	Procurez-vous auprès de n’importe quel fabricant
Cytation5 Lecteur de microplaques	BioTek	CYT5MF	Procurez-vous auprès de n’importe quel fabricant, utilisez n’importe quel système capable de quantifier avec précision le logiciel d’analyse de données d’ADN
(QuantaSoft et QuantaSoft Data Analysis Pro)	Bio Rad	Il	faut se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
ddPCR 96-Well Plates	Bio Rad	12001925	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Il n’existe pas encore d’alternatives.
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
ddPCR Supermix pour sondes (pas de dUTP)	Bio Rad	1863024	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Il n’existe pas encore d’alternatives.
Cartouches DG8 pour générateur de gouttelettes QX200/QX100	Bio Rad	1864008	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
Joints DG8 pour générateur de gouttelettes QX200/QX100	Bio Rad	1863009	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
Huile de génération de gouttelettes pour sondes	Bio Rad	1863005	Doit se procurer des approvisionnements en ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
Kanamycin	ThermoFisher Scientific	BP906-5	Procurez-vous auprès de n’importe quel fabricant
Gélose Luria-Bertani	ThermoFisher Scientific	BP1425-2	Procurez-vous-le de n’importe quel fabricant ou fabriquez-le vous-même à partir d’agar, de tryptone, de levure et de
bouillon NaCl Luria-Bertani	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	Procurez-vous-vous auprès de n’importe quel fabricant ou fabriquez-le vous-même à partir de tryptone, de levure et de NaCl
Thermoscellage à plaque PCR, feuille, perçage	Bio Rad	1814040	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Des alternatives ne sont pas encore disponibles.
Tubes PCR	Eppendorf	951010022	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Boîtes de Pétri	ThermoFisher Scientific	FB0875712	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
pPCR Script Cam SK+	Stratagene/Agilent	211192	N’est plus disponible dans le commerce Primer
/Probe Design	IDT	N/A	https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP et pSKAP_Barcodes	Addgene	Numéros de plasmide 122702-122726	www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
QX200 Générateur de gouttelettes	Bio Rad	1864002	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
QX200 Lecteur de gouttelettes	Bio Rad	1864003	Doit se procurer des fournitures ddPCR auprès de Bio Rad. Les alternatives ne sont pas encore disponibles.
Salmonella typhimurium souche ATCC 14028s	ATCC	ATCC 14028s	www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate	BioTek	TAKE3	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant, utiliser n’importe quel système capable de quantifier avec précision l’ADN
Thermo Scientific FastDigest BamHI	ThermoFisher Scientific	FERFD0054	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Thermo Scientific FastDigest DpnI	ThermoFisher Scientific	FERFD1704	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Thermo Scientific FastDigest HindIII	ThermoFisher Scientific	FERFD0504	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0832	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Thermo Scientific GeneJet Miniprep	Kit ThermoFisher Scientific	FERK0503	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	F534L	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Thermo Scientific T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	FEREL0011	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Thermocycler	Bio Rad	1861096	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant
Transilluminateur UVP Visi-Blue	ThermoFisher Scientific	UV95043301	Ou autre transiluminateur qui permet la visualisation de l’ADN de l’eau
, Biologie moléculaire Grade	ThermoFisher Scientific	BP28191	Se procurer auprès de n’importe quel fabricant