Summary
Her presenterer vi en protokoll som bruker nær-infrarøde fargestoffer i forbindelse med immunhistokjemi og høyoppløselig skanning til analysen proteiner i hjernen regioner.
Abstract
Nevrovitenskap er studiet av hvordan cellene i hjernen megle ulike funksjoner. Måle protein uttrykk i neurons og glia er avgjørende for studiet av nevrovitenskap som cellulær funksjon bestemmes av sammensetningen og aktiviteten av cellulære proteiner. I denne artikkelen beskriver vi hvordan immuncytokjemi kan kombineres med nesten infrarød høyoppløselig skanning for å gi en semi-kvantitativ måling av protein uttrykk i forskjellige hjerneområder. Denne teknikken kan brukes for enkle eller doble protein uttrykk i samme hjernen regionen. Måle proteiner på denne måten kan brukes til å få en relativ endring i protein uttrykk med en eksperimentell manipulasjon, molekylær signatur av læring og hukommelse, aktivitet i molekylær trasé, og nevrale aktivitet i flere hjerneområder. Ved hjelp av riktige proteiner og statistisk analyse kan funksjonell tilkobling mellom hjerneregioner også fastslås. Gitt den enkle implementeringen av immuncytokjemi i et laboratorium, kan bruk av immuncytokjemi med nesten infrarød høyoppløselig skanning utvide muligheten av hjerneforsker til å undersøke nevrobiologiske prosesser på systemnivå.
Introduction
Studiet av nevrovitenskap gjelder en undersøkelse av hvordan cellene i hjernen megle bestemte funksjoner1. Disse kan være cellulære i naturen, for eksempel hvordan glia celler gir immunitet i sentralnervesystemet eller kan involvere eksperimenter som tar sikte på å forklare hvordan aktiviteten til nevroner i rygg hippocampus fører til romlig navigering. I en bred forstand, er cellulær funksjon bestemmes av proteiner som er uttrykt i en celle og aktiviteten til disse proteinene2. Som et resultat, måle uttrykk og/eller aktivitet av proteiner i hjerneceller er avgjørende for studiet av nevrovitenskap.
En rekke teknikker er tilgjengelige for å måle protein uttrykk i hjernen. Disse inkluderer in vivo-metoder som positron utslipps topografi for reseptor tetthet3 og mikro-dialyse for små peptider4. Mer vanlig, ex vivo metoder brukes til å undersøke protein funksjon og uttrykk. Disse inkluderer masse massespektrometri teknikker5, Western Blot og enzym-knyttet immunosorbentanalyse ANALYSEN (Elisa)6, og immuncytokjemi7. Immuncytokjemi er mye brukt i feltet av nevrovitenskap. Denne teknikken innebærer bruk av et primært antistoff for å oppdage et protein (eller antigen) av interesse (f. eks c-Fos) og et bøyd sekundært antistoff for å oppdage protein-primære antistoff kompleks (figur 1). For å muliggjøre påvisning av protein-primære antistoff-sekundære antistoff kompleks, sekundære antistoffer har Oksiderende stoffer som pepperrot peroksidase (HRP) bøyd til dem. Dette gir mulighet for dannelse av precipitates i celler som kan oppdages ved hjelp av lys mikroskopi7. Sekundære antistoffer kan også ha kjemikalier fluorescerer bøyd til dem (dvs. fluorophores). Når stimulert disse kjemikaliene avgir lys, som kan brukes til å oppdage protein-primære antistoff-sekundære antistoff komplekser7. Endelig, noen ganger primære antistoffer har redusere agenter og fluorescens kjemikalier knyttet til dem direkte benektende behovet for sekundære antistoffer7 (figur 1).
Interessant, mange immuncytokjemi metoder tillater visualisering av proteiner i hjerneceller, men ikke evnen til å kvantifisere mengden protein i en bestemt celle eller hjerne regionen. Bruk av lys mikroskopi for å oppdage precipitates fra reduksjons reaksjoner gir mulighet for visualisering av neurons og glia, men denne metoden kan ikke brukes til å kvantifisere protein uttrykk i celler eller i en bestemt hjerne region. I teorien kan fluorescens mikroskopi brukes til dette, fordi lyset som slippes ut fra det fluorescerende sekundære antistoff er et mål på protein-primære antistoff-sekundære antistoff kompleks. Men autofluorescence i hjernevevet kan gjøre det vanskelig å bruke fluorescens mikroskopi å kvantifisere protein uttrykk i hjernevevet8. Som et resultat, lys slippes ut fra fluorescerende bilder av hjernevevet er sjelden brukt til å kvantifisere protein uttrykk i hjernen.
Mange av disse problemene kan løses ved hjelp av nær-infrarød immuncytokjemi i forbindelse med høyoppløselig skanning9,10. I denne artikkelen beskriver vi hvordan immuncytokjemi kombinert med fluorophores i nær infrarød stråling Spectra kan kombineres med høyoppløselig skanning (for eksempel 10 – 21 μm) for å oppnå skarpe bilder som tillater semi kvantifisering av protein i forskjellige hjernen regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Delaware. Mannlig Sprague Dawley rotter ca 55 – 75 dager gamle var anvendt for denne protokollen.
1. Brain ekstraksjon og vevs forberedelser
- Bedøve rotte med isoflurane i anestesi induksjon kammer til rotte ikke lenger utstillinger et svar til fots knipe.
- Ofring rotter via rask halshogging benytter en giljotinen.
- Skjær huden på skallen bakre til fremre og klar fra toppen av skallen.
- Bruk benrongeurer å forsiktig fjerne baksiden del av Skull, og så benytter liten dissekere saks hugge ned midtlinjen av Skull, presser oppadstigende imot overdelen av Skull til alle tider å unngå skadelige det hjerne tissue.
- Bruk benrongeurer til å skrelle vekk høyre og venstre halvdel av skallen for å utsette hjernen.
- Bruk en liten slikkepott til å øse under hjernen og bryte nerver, nøye heve hjernen og fryse hjernen i isopentane kjølt på tørr is (minst-20 ° c). Etter dette, Oppbevar hjerner i en-80 ° c fryser til kutting.
- Slice hjerner i områder av interesse på 30-50 μm i en kryostaten opprettholdes mellom-9 ° c og-12 ° c. Direkte montere skiver på glass lysbilder og lagre i en-80 ° c fryser til tidspunktet for immuncytokjemi analysen.
Merk: I denne protokollen hjernen områder av interesse var hippocampus og amygdala.
2. single Immunhistokjemiske reaksjon
Merk: For dobbel immunhistokjemiske reaksjon er protokollen den samme som singelen immunhistokjemiske reaksjonen bortsett fra denne reaksjonen har to primære antistoffer av forskjellige verter (f. eks kanin og mus) og to sekundære antistoffer for tilsvarende primærvalg bør være fra en enkelt vert (f. eks geit antirabbit og geit antimouse). Den sekundære antistoffer må også være fra to forskjellige Spectra som er tilgjengelige i høy oppløsning skannere. For eksempel, ett sekundært antistoff med et utslipps spektrum topp på 680 NM og ett sekundært antistoff 800CW (utslipps spektrum peak ved 780 NM).
- Fjern glass lysbilder fra fryseren og la det likevekt til romtemperatur i 30 min.
- Under en avtrekks hette, fikse hjernevevet i 4% paraformaldehyde i 0,1 M fosfat bufret saltvann (PBS) for 1 − 2 timer ved romtemperatur.
- Skyll lysbildene i 0,1 M Tris bufret saltvann (TBS) tre ganger i 10 minutter hver. Permeabilize cellemembraner ved å incubating lysbildene i et mildt vaskemiddel (f.eks. 0,01% vaskemiddel) i 30 − 60 min.
- Skyll lysbildene i TBS tre ganger for 15 min hver.
- Fortynne primære antistoff for protein av interesse i PBS i riktig konsentrasjon. Hvis du for eksempel vil oppdage det umiddelbare tidlige genet c-Fos, klargjør du en kanin primær anti c-Fos-antistoff i en konsentrasjon på 1:500.
- Pipetter primære antistoff løsning direkte på hjernevevet (ca 200 μL per 3 tommer x 1 tomme Slide).
- Bruk coverslips til å ruge hjernevevet på glass lysbilder i primær antistoff fortynning for enten 1 − 2 timer ved romtemperatur eller over natten (~ 17 h) ved 4 ° c.
- Fjern coverslips og vaske lysbilder i TBS som har en liten mengde vaskemiddel lagt til det (f. eks, 0,01% vaskemiddel, "TBS-T") fire ganger i 15 min hver.
- Bruk coverslips for å ruge hjernens seksjoner i et sekundært antistoff ved romtemperatur i 2 timer.
Merk: Det sekundære antistoff må være til riktig fortynning og i en fortynningsvæske som inneholder TBS, vaskemiddel, og 1,5% av verts serum. For eksempel vil en geit sekundært antistoff i en fortynning av 1:2000 inneholde 1,5% geit serum og 0,05% vaskemiddel. - Skyll lysbildene i TBS-T fire ganger for 20 min hver, og deretter i TBS fire ganger for 20 min hver.
- Tørr lysbilder ved romtemperatur i mørket over natten. Når lysbildene er tørre, er de klare for bildebehandling.
3. avbildning
- Plasser lysbildene på det nesten infrarøde skanne grensesnittet med vevet vendt ned. Enten bilde ett glass lysbilde eller flere lysbilder om gangen ved hjelp av et markeringsverktøy.
- Bilde lysbildene med den høyeste Kvalitetsinnstillingen med en forskyvning på 0 NM og en oppløsning på 21 μm. Skanningen tar vanligvis 13 − 19 timer, avhengig av hvilket skanne utstyr som brukes.
- Importer bilder til bildeanalyse programvaren (f.eks. ImageStudio) for å vise og merke for semi-kvantitativ proteinanalyse.
4. protein Expression analyse
- Åpne bildeanalyse programmet, og velg arbeidsområdet der bildet ble skannet.
- Åpne det skannede bildet i bildeanalyse programmet for å vise skanningen, og Juster hvilke bølgelengder som vises, i tillegg til kontrast, lysstyrke og forstørrelse, uten å endre det ubehandlede bildet eller det totale kvantifisert utslippet.
- Identifiser nøkkelområdene for kvantifisering, og velg analyse -fanen øverst på siden, og velg deretter tegne rektangel (eller tegn ellipse/tegn Frihånd) for å tegne et rektangel over området som skal kvantifisert.
- Hvis du vil vise størrelsen på rektanglet, velger du figurer nederst til venstre på skjermen, og deretter velger du kolonner langs bunnen til høyre. Legg til høyde -og bredde Kol onner for å identifisere figurstørrelsen.
Merk: Det er viktig å kontrollere for figurstørrelse når du sammenligner kvantifisering. Det anbefales å bruke identiske figurer plassert innenfor ønsket kvantifisering sted, for å få en nøyaktig prøvetaking av utslippene for den regionen. - Deretter navn formen og gjenta. Når alle regioner er samplet dataene tilgjengelig fra kolonnene kategorien kan samles og analyseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før du bruker høyoppløselig skanning for immunhistokjemi, bør man verifisere at protokollen fungerer. Dette kan oppnås ved hjelp av en validering analysen der hjernen deler fra samme dyret er inkubert med primære og sekundære antistoffer, sekundær antistoff alene, eller verken primære eller sekundære antistoff. Resultatene for en slik validerings analyse er vist i figur 2. I denne reaksjonen var vi påvise den umiddelbare tidlige genet c-Jun i rygg hippocampus og amygdala. C-Jun uttrykket ble bare observert når primære og sekundære antistoffer ble brukt på hjernevevet.
Figur 3 viser dobbelt protein deteksjon i amygdala kjerner. I dette eksperimentet vi analyseres den GluR1 delenhet av α-amino-3-AHA-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) reseptor og NR2A delenhet av N-metyl-D-aspartate reseptor (NMDA) reseptor i samme hjernevev. Dette tillot oss å undersøke forholdet mellom AMPA/NMDA reseptorer i sub-kjerner av amygdala. Dette forholdet er en nevrobiologiske signatur av læring og minne11,12. Som kan sees i Figur 3, signal for GluR2 (780 NM lys pseudo farget i grønt) og NR2A (680 NM lys pseudo farget i rødt) kan bare observeres i hjernevevet som ble utsatt for primære og sekundære antistoffer.
Figur 4 viser hvordan gjennomsnittet og normalisert tiltak av protein uttrykk kan fås fra høy oppløsning skanninger i ventrale hippocampus. Ved hjelp av bildeanalyse programvare, er et rektangel plassert i regionen av interesse (molekylær lag av CA1) og gjennomsnittlig intensitet av lys fra formen kan brukes som et mål på fluoroforen uttrykk (figur 4a). I sin tur er dette et mål på protein uttrykk (dvs. antigen-primære antistoff-sekundære antistoff kompleks). Figuren kan også plasseres på tvers av en region som uttrykker høyt signal og lavt signal for å oppnå en normalisert kurve (figur 4b). I dette eksempelet ble et rektangel plassert på tvers av molekyl laget av CA1, men dekket dendrittiske felt også, som ikke uttrykker betydelige mengder c-Jun i denne analysen. Området under kurven kan deretter brukes som et mål på protein uttrykk. Hvis oppsettet i et eksperiment omfatter behandlingsgrupper (f.eks. stress eksponering) og en kontroll, kan relative endringer i protein uttrykket i hjernen fås.
Figur 1 : Illustrasjon av immunhistokjemiske reaksjon ved bruk av primær (1m) og sekundær (2nd) antistoffer eller bare primær antistoff. Fylte svarte sirkler representerer en etikett, som kan være et oksiderende middel som pepperrot peroksidase eller en fluoroforen, for eksempel bor-dipyrromethene (BODIPY). Grønne firkanter representerer antigen (på protein av interesse) som oppdages i immunhistokjemiske reaksjonen.
Figur 2 : Bilder av en validering analysen for påvisning av c-jun. I denne analysen, vev fra samme dyret ble behandlet med en kanin primære antistoff som anerkjenner c-Jun og geit antirabbit sekundære antistoff med vedlagt fluoroforen med utslipp på 780 NM (pseudo farget i grønt, venstre panel). Tilstøtende vev ble behandlet med enten sekundær antistoff alene (midtre panel) eller ingen antistoff (høyre panel). Skala bar = 1 mm.
Figur 3 : Validering analysen for dobbel merking immunhistokjemiske reaksjon i amygdala. Tre eksemplarer hjerne deler fra samme rotte var enten eksponert for kanin antistoff som anerkjenner GluR1 og mus antistoff som anerkjenner NR2A (venstre panel), sekundært antistoff (midtre paneler), eller ingen antistoff (høyre panel). GlurR1 ble visualisere med geit anti kanin 800CW sekundære antistoff (780 NM, pseudo farget i grønt) og NR2A ble visualisere ved hjelp av en geit antimouse 680RD sekundære antistoff (680 NM, pseudo farget i rødt). Scale bar = 1 mm. OT = optisk skrift; IC = intern kapsel; EC = ekstern kapsel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Få semi kvantitative tiltak av protein uttrykk i hjernevevet. (A og B) skjermbilder av scoret bilder i bildeanalyse programvaren som brukes til å analysere bilder fra skanneren. Tissue var fra ventrale hippocampus og behandlet for å visualisere c-jun. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultatene som presenteres i denne artikkelen viser at nær-infrarød immuncytokjemi i kombinasjon med høyoppløselig skanning kan brukes til å få semi-kvantitative målinger av protein uttrykk i hjernevevet. Den kan også brukes til å merke to proteiner samtidig i samme hjerne region. Vi har tidligere brukt nesten infrarød immunhistokjemi til å måle umiddelbare tidlige genuttrykk i flere hjerneområder9,10. Umiddelbare tidlige gener kan brukes som et mål på neural aktivitet. Vi har også utsatt disse semi-kvantitative tiltak av protein uttrykk til statistiske analyser som tillot oss å gruppere hjernen regioner med korrelert nivåer av umiddelbare tidlige gener (beina). Vi brukte dette som et mål på funksjonell tilkobling for å undersøke hvordan stress påvirker funksjonell tilkobling mellom noder i frykt kretsen under emosjonell læring og minne9,10. Vi viste hvordan AMPA/NMDA prosenter (en signatur av læring og minne) kan måles ved hjelp av nesten infrarød immuncytokjemi med høy oppløsning skanning13. En lignende teknikk kan brukes til å måle pan og fosfat-proteiner for å bestemme molekylær signalering. Dette oppnås ved hjelp av Western Blot14. Dette krever imidlertid dissekere hjerneområder av tykke hjerne skiver og er ikke mottagelig for små hjerneområder. Dette problemet kan omgås ved hjelp av nesten infrarød immuncytokjemi med skanning med høy oppløsning. Til slutt, alle immuncytokjemi bilder er digitalisert, noe som gir mulighet for ubegrenset lagring og praktisk re-analyse av tidligere analyser.
Som med alle metoder er det ulemper. Det er ingen forstørrelse i høy oppløsning skannere og behandling av vev ikke lett tillate undersøkelser ved hjelp av fluorescens mikroskopiske teknikker. Selv tar alternative skiver fra hjernen kanskje ikke fungerer, siden konfokalmikroskopi mikroskopi kan fungere best i perfusert hjernevev, men nær-infrarød Imaging med høy oppløsning skanning er vanligvis gjort på Flash frosne hjerner. Protein uttrykk i spesifikke neurons (f. eks, interneuron vs pyramideformet Nevron) eller ulike celletyper i hjernen (f. eks, neurons vs glia) kan ikke bestemmes ved hjelp av nær-infrarød immuncytokjemi med høy oppløsning skanning. Utføre validering analyser er avgjørende fordi dette er fortsatt en relativt ny metode for å undersøke protein uttrykk i hjernevevet.
Når den brukes på riktig måte, tilbyr nær-infrarød immuncytokjemi med høyoppløselig skanning fordeler. Autofluorescence i hjernevevet er redusert i nær-infrarød rekkevidde, semi-kvantitative tiltak av protein uttrykk kan fås, uttrykk for to proteiner i samme hjerne regionen kan fås, og bilder av analysen kan lagres på ubestemt tid. Når sammenkoblet med riktig protein og/eller statistisk metode denne teknikken kan brukes til å undersøke protein uttrykk, neural aktivitet, molekylær signalering, og funksjonell tilkobling i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskningen i denne rapporten ble finansiert av et mål stipend fra NIGMS (1P20GM103653) tildelt DK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
