Summary
ونحن وصف إجراءات لمعالجه انسجه المخ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الدقة لتحليل مورفرومتري من توزيع الحويصلات متشابك في المحطات العصبية. الرسوم البيانية التي تم الحصول عليها مع هذه الأساليب يمكن أيضا ان تستخدم لدراسة المورفولوجية لعدد من المكونات الخلوية الأخرى وعلاقتاتها الهيكلية الابعاد.
Abstract
وقد استغل مختبرنا وغيرها الكثير من قوه حل عاليه من انتقال المجهر الكترون لدراسة المورفولوجية والتنظيم المكاني من الحويصلات متشابك. من أجل الحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الجودة التي يمكن ان تسفر عن درجه من التفاصيل المورفولوجية اللازمة للتحليل الكمي للتوزيع قبل متشابك الحويصلة ، اعداد العينة الأمثل أمر بالغ الاهميه. التثبيت الكيميائي هو الخطوة الاولي في عمليه اعداد العينات ، وذات اهميه قصوى للحفاظ علي البنية الدقيقة. تثبيت الاوعيه الدموية مع محلول الفورمالديهايد جلوتارالدهيد ، تليها معالجه العينات الذبذبات مع الاوزميوم tetroxide ، تستقر الحد الأقصى لعدد الجزيئات ، وخاصه البروتينات والدهون ، والنتائج في الحفظ المتفوق من البنية الفوقية. ثم تتم معالجه الانسجه مع المضادة للتلوين ، والجفاف متسلسلة والراتنج التضمين. ان تلطيخ كتله مع خلات اليورانيل (اي ، تلطيخ الانسجه الذبذبات الداخلية قبل التضمين الراتنج) يعزز التباين الذاتية وتستقر مكونات الخلية ضد الاستخراج اثناء معالجه العينات. ويمكن زيادة التباين من خلال تطبيق خلات اليورانيل كوصمه عار علي أقسام سامسونج. المزدوج تلطيخ المقاطع سامسونج مع سترات الرصاص بعد العلاج خلات اليورانيل يحسن أيضا دقه الصورة ، من خلال تكثيف الكترون التعتيم من الهياكل التي تحتوي علي حمض نووي من خلال ملزمه انتقائية من الرصاص إلى خلات اليورانيل. المجهر الكترون الإرسال هو أداه قويه لتوصيف التفاصيل المورفولوجية من الحويصلات متشابك والتقدير الكمي من حجمها والتنظيم المكاني في محطه بوتون. ومع ذلك ، لأنه يستخدم الانسجه الثابتة ، ونقل المجهر الكترون لا يمكن الا ان توفر معلومات غير مباشره فيما يتعلق بالحياة أو العمليات المتطورة. ولذلك ، ينبغي النظر في التقنيات الأخرى عندما يكون الهدف الرئيسي هو دراسة الجوانب الديناميكية أو الوظيفية لعمليات الاتجار بالحويصلات المتشابكة وندره المحببات.
Introduction
ونحن وصف أساليب لاعداد انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الكترونات عاليه الجودة المجهرية للتحليل في العمق مورفمتري من التوزيع المكاني فيجليد متشابك في المحطات العصبية1،2. ويمكن أيضا استخدام الرسومات المجهرية عاليه التباين التي يمكن الحصول عليها من خلال معالجه العينات بعد هذه الطرق لدراسة المورفولوجية التفصيلية لعدد من المكونات الخلوية وعلاقتاتها الهيكلية الابعاد3,4.
المجهر الكترون الإرسال (TEM) هو أداه قويه لدراسة المورفولوجية من العضيات وغيرها من الهياكل الخلوية كميا. اعتبارا من هذا العقد ، لا توجد طرق أخرى للتحقيق التي يمكن ان توفر نفس الدرجة من القرار من الاغشيه الدهنية والعضوية بدون وضع العلامات المناعية ، باستثناء كريوفيكسيشن بالضغط العالي التجميد. ومع ذلك ، لا تستخدم تقنيات استبدال التجميد علي نطاق واسع ، وتتطلب عاده معدات باهظه الثمن وأوقات اعداد طويلة.
من أجل الاستفادة من قوه الحل العالية لل TEM ، يعد الاعداد الأمثل للعينه أمرا بالغ الاهميه. الأهداف الرئيسية لاعداد العينات هي الحفاظ علي بنيه الانسجه مع الحد الأدنى من التغيير من الدولة الحية ، وتعزيز النقيض من العينة ، واستقرار الانسجه ضد استخراج المكونات الخلوية اثناء المعالجة والتعرض للكترون شعاع. وقد أدخلت العديد من البروتوكولات لاعداد الانسجه TEM والكمال من قبل العديد من المختبرات علي مر السنتين. وقد ركزت العديد منهم علي أساليب التصور الأمثل من الحويصلات متشابك5,6,7,8,9,10,11. من بين عدد من الأساليب الراسخة ، والذهب القياسية المستخدمة حاليا ، اخترنا إجراءات لتثبيت الكيميائية ، وتثبيت وظيفة ، وتلطيخ كتله ، والجفاف متسلسلة ، وتضمين الراتنج واخر تلطيخ التي تهدف إلى الحفاظ علي هيكل الانسجه الأمثل تحقيق التباين صوره ممتازة. من الملاحظة ، يمكن ان يكون الحفاظ علي البنية الدقيقة صعبا بشكل خاص عند العمل مع انسجه المخ الفئران حديثي الولادة. في الواقع ، يتميز الجهاز العصبي المركزي للحيوانات الصغيرة جدا بمحتوي المياه اعلي من الدماغ الكبار ، وتوسيع أكثر بروزا من المساحات خارج الخلية ، والاتصالات أكثر مرونة بين الخلايا12. وهذا يجعل انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة حساسة للغاية للتغيرات في osmolarity ، وعرضه بشكل رائع لانكماش الارتيقيه و/أو تورم عند معالجتها من خلال حلول متسلسلة من قوه انقباض مختلفه12. ولذلك ، استخدمت أساليبنا الحلول لمعالجه العينات التي هي من الاسموليه أقرب ما يمكن إلى ان من الفئران الوليد الدماغ. وكان هدفنا الحصول علي صور عاليه الجودة وعاليه الدقة المجهر الكتروني للتقييم الكمي للتوزيع المكاني لحويصلات متشابك في المحطات العصبية. علي وجه التحديد ، سعينا لقياس عدد الحويصلات داخل المحطة العصبية ، والمسافة من الحويصلات متشابك من غشاء البلازما قبل متشابك ، وعدد من الحويصلات رست في الغشاء قبل متشابك ، وحجم الحويصلات متشابك المسافات بين الحويصلات1.
التثبيت الكيميائي المرضي هو شرط أساسي للحصول علي الرسوم المجهرية الكترون عاليه الجودة التي يمكن ان توفر التفاصيل المورفولوجية اللازمة لدراسة التشكل الحويصلة المتشابكة والتنظيم المكاني. علي الرغم من وجود عده طرق للتثبيت, تثبيت انسجه المخ عن طريق التروية الوعائية هو بالتاكيد متفوقة علي أساليب أخرى. منذ التثبيت عن طريق التروية الوعائية يبدا مباشره بعد إلقاء القبض علي الدورة الدموية الجهازية ، فانه يقصر الفاصل الزمني بين الاكسده من انسجه المخ وعبر ربط البروتينات مع المثبتات ، مما ادي إلى الحد الأدنى من التعديلات في الخلية هيكل. وعلاوة علي ذلك ، فانه يحقق اختراق سريع وموحد ، وذلك بسبب التدفق السريع من المثبت من سرير الاوعيه الدموية إلى المقصورات خارج الخلية والخلوية12،13،14. التثبيت الاولي مع غلوتارالديهيد ، تليها التثبيت الثانوي (بعد التثبيت) مع الاوزميوم tetroxide ، غله ممتازة الحفاظ علي هيكل غرامه15،16،17. مزيج من غلوتارالديهيد وبارافورمالدهيد لديه ميزه اضافيه لاختراق أكثر سرعه في الانسجه12.
نظرا لان الانسجه البيولوجية ليست جامده بما فيه الكفاية ليتم قطعها إلى أقسام رقيقه دون دعم مصفوفة الراتنج ، فانها تحتاج إلى ان تكون جزءا لا يتجزا في وسط قبل التقطيع رقيقه. المياه-immiscible راتنجات الايبوكسي تستخدم عاده كوسيلة التضمين في TEM. عند استخدام هذا النوع من المصفوفة ، يجب استبدال جميع المياه المجانية للعينه بمذيب عضوي قبل تسلل الراتنج. يتم أزاله المياه عن طريق تمرير العينة من خلال سلسله من الحلول لتركيزات تصاعدية من الايثانول و/أو الأسيتون12. في هذا البروتوكول ، والعينات هي أول شقه جزءا لا يتجزا بين أوراق aclar مرنه ، ثم جزءا لا يتجزا في كبسوله. والنتيجة النهائية هي الانسجه التي تقع في طرف كتله الراتنج أسطواني ، والتي لديها الهندسة المثالية لتكون اقل تاثرا بالاهتزازات الناشئة خلال ميكروتومي التماس.
تلطيخ مع المعادن الثقيلة لتعزيز التباين الانسجه الذاتية هو جانب آخر مهم من اعداد العينة. ويرجع تباين الصورة في TEM إلى تشتت الكترونات بواسطة الذرات في الانسجه. ومع ذلك ، تتكون المواد البيولوجية إلى حد كبير من جزيئات منخفضه الوزن الذري (اي الكربون والهيدروجين والأكسجين والنيتروجين). ولذلك ، فان توليد تباين التشتت الكافي يتطلب دمج ذرات الوزن الذري العالية في المكونات الخلوية للانسجه. ويتحقق ذلك من خلال تلطيخ العينة مع المعادن الثقيلة12،18،19. الاوزميوم tetroxide ، واليورانيوم والرصاص ، والتي تربط بقوة للدهون ، هي المعادن الثقيلة الأكثر شيوعا المستخدمة كبقع الكترون.
الاوزميوم (الرقم الذري 76) هي واحده من المعادن الأكثر كثافة في الوجود. وهو علي حد سواء المثبت ووصمه عار, علي الرغم من ان دورها الأساسي في TEM كما هو مثبت موثوق12. من بين بروتوكولات التثبيت المختلفة في الاستخدام ، وطريقه التثبيت المزدوج مع غلوتارالديهيد تليها الاوزميوم هو الأكثر فعاليه في الحد من استخراج مكونات الخلية اثناء اعداد العينة. وتستخدم هذه المثبتات اثنين لتحقيق الاستقرار في الحد الأقصى لعدد من أنواع مختلفه من الجزيئات ، وخاصه البروتينات والدهون ، ويؤدي إلى الحفاظ علي متفوقة من الانسجه البنية العالية12،14،15، 16 , السابعة عشره
اليورانيوم (الرقم الذري 92) هو أثقل المعادن المستخدمة كبقعه الكترون ، ومعظمها عاده في شكل خلات اليورانيل. بالمثل إلى الاوزميوم, يتصرف هو بما ان وصمه عار ومثبت, رغم ان دوره أساسيه في [تيم] كوصمه عار20,21. الأحماض النووية التي تحتوي علي والهياكل غشائي ملطخه بشده وبشكل تفضيلي مع أملاح اليورانيل في الدهيد-الانسجه الثابتة22،23. علاج الانسجه مع خلات اليورانيل بعد osmication وقبل الجفاف يؤدي إلى استقرار غشائي والبني التي تحتوي علي الأحماض النووية ، فضلا عن التباين المعزز ، ويسمح بتحديد بعض التفاصيل الهيكلية التي لن يمكن الكشف عنها بسهوله في عينات ملطخه الاوزميوم وحدها12،24،25. ويعتقد ان خلات اليورانيل قد استقرار هيكل غرامه من خلال الجمع بين مع انخفاض الاوزميوم التي تم إيداعها علي اغشيه الدهون خلال osmication24. ويتحقق الحد الأقصى من التباين عندما يتم تطبيق خلات اليورانيل قبل تضمينها وباعتبارها بعد وصمه عار في المقاطع رقيقه12.
الرصاص (الرقم الذري 82) هو وصمه عار الأكثر شيوعا المستخدمة لل TEM ويستخدم أساسا لما بعد تلطيخ من أقسام رقيقه. أملاح الرصاص لديها التعتيم الكترون عاليه وإظهار تقارب لمجموعه واسعه من الهياكل الخلوية ، بما في ذلك الاغشيه والبروتينات النووية والخلوية ، والأحماض الامينيه والجليكوجين26،27. عندما يتم استخدام طريقه تلطيخ مزدوجة (اي ، تلطيخ مع خلات اليورانيل متبوعا بالعلاج مع الرصاص) ، وهذا الأخير بمثابه مطور من تلطيخ خلات اليورانيل. علي سبيل المثال ، يؤدي بعد تلطيخ الكروماتين الثابتة مع غلوتارالديهيد يزيد امتصاص اليورانيل خلات بعامل من ثلاثه28، 29،30،31،32. الرصاص يعزز أيضا تلطيخ المنقولة من المعادن الأخرى مثل الاوزميوم. ويعتقد ان الأملاح الرصاص وصمه عار الاغشيه من الانسجه الاوزميوم الثابتة عن طريق ربط للمجموعة القطبية من الفوسفاتيدات في وجود انخفاض الاوزميوم33. عيب محتمل من تلطيخ مع كل من خلات اليورانيل والرصاص ، وخاصه بالنسبة لفترات طويلة ، هو ان العديد من العناصر الهيكلية المختلفة ملطخه بالتساوي وغير علي وجه التحديد ، التالي قد لا يكون من السهل تمييزها عن بعضها البعض12 .
الإدخال الأخير لمصادر الضوء البديلة ، مثل المجهر الضوئي البصري فائق الدقة المنشط للصور ، قد تحسن بشكل كبير من دقه المجهر الضوئي34. ومع ذلك ، نظرا لان المجهر الضوئي يعتمد علي الطرق الكيميائية النسيجية والمناعية-الكيميائية لتصور البروتينات أو الانزيمات الموسومة بشكل فردي ، فان قوه TEM لعرض جميع العناصر الهيكلية في ان واحد تبقي غير مسبوقة للدراسة المتعمقة علاقات المورفولوجية والابعاد لهياكل الانسجه. علي وجه الخصوص ، لا يمكن لأي تقنيه أخرى توفير التفاصيل المورفولوجية اللازمة لاجراء تحليل مورفرومتري من توزيع الحويصلات متشابك في العصب العصبي قبل متشابك. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان الرسوم المجهرية الكترون التقاط هيكل النسيج بعد وفاه الكائن الحي ، التالي فانها لا يمكن ان توفر معلومات بشان ديناميات الاتجار بالحويصلات قبل متشابك والانتشار. التالي, أدوات أخرى, مثل التصوير الحية FM صبغ والتصحيح المشبك الكهربائية, وينبغي النظر عندما يكون الهدف الرئيسي هو دراسة الجوانب الحيوية و/أو الوظيفية من الاتجار بالحويصلات متشابك وكثرة المحببات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة علي جميع الدراسات من قبل اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها في جامعه فيرجينيا (شارلوتسفيل, VA) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة.
1. تثبيت بواسطة Perfusion الاوعيه الدموية
ملاحظه: وصف عام للأسلوب الفئران الاوعيه الدموية ترويه وقد سبق تفصيلها في هذه المجلة13 وخارج نطاق هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فان الخطوات التالية محدده لاعداد انسجه المخ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الجودة للتحليل الكمي للتوزيع الحويصلات متشابك في محطات ما قبل متشابك.
-
تحضير 4% بارافورمالدهيد
- مكان 800 mL من 0.1 M الفوسفات العازلة (PB) في كوب الزجاج 2 لتر علي لوحه التحريك تحت غطاء الدخان. الحرارة إلى ما يقرب من 60 درجه مئوية دون غلي العازلة.
- أضافه 40 غرام من مسحوق بارافورمالدهيد. يحرك باستمرار
- في حين قياس درجه الحموضة ، أضافه قطرات صغيره من 10 N NaOH حتى يتم مسح الحل. يجب ان يكون الأس الهيدروجيني النهائي 7.2-7.4.
- أضافه المتبقية 0.1 M PB إلى الحجم النهائي من 1 لتر. اسمحوا بارد ، فلتر مع غشاء 0.45 μm وتخزين في 4 °C بين عشيه وضحيها.
ملاحظه: اعداد بارافورمالدهيد الطازجة في اليوم قبل perfusion.
تحذير: استنشاق أبخره الديهيد يمكن ان يسبب اعراض الأنف وتهيج مجري التنفس. الاحتكاك بالجلد يسبب التهاب الجلدي. يجب التعامل مع الديهيديس في غطاء الدخان اثناء ارتداء القفازات والعباءة الواقية ونظارات الأمان
-
اعداد حل تيرودي
- ضع 1 لتر من الماء المقطر في كوب زجاجي علي لوحه تحريك. أضف كلوريد الصوديوم (8 غرام) ، KCl (0.15 g) ، CaCl2 (0.1 g) ، mgcl2 (0.006 غرام) ، الجناح2PO4 (0.055 g) ، نهاسكو3 (1 غرام) وسكر العنب (1 غرام) في الدورق.
- يحرك باستمرار وقياس درجه الحموضة. الحفاظ علي درجه الحموضة بين 7.2 و 7.4.
ملاحظه: تيرودي الحل هو أيضا متاحه تجاريا.
- مزيج 4 ٪ بارافورمالدهيد مع غلوتارالديهيد في تركيز النهائي من 2 ٪. أضافه 40 mL من الكترون المجهر الصف 50 ٪ غلوتارالدهيد إلى 1 لتر من 4 ٪ بارافورمالدهيد. اخلطي جيدا في طبق التحريك
ملاحظه: وهناك حاجه إلى ما يقرب من 100 مل من محلول التثبيت البارافورمالدهيد-غلوتارالديهيد لحقنت الجسم من الفئران حديثي الولادة. لذلك ، لا يقل عن 10 الفئران حديثي الولادة يمكن perfused مع 1 لتر من fixative. لا تخلط بارافورمالدهيد والغلوتارالدهيد حتى قبل الاستخدام مباشره. جلب جميع الحلول لدرجه حرارة الغرفة قبل perfusion. - مره واحده وقد اكتسبت الوصول إلى البطين الأيسر (انظر بروتوكول ترويه الحيوانية كله13), مسح نظام الاوعيه الدموية مع حل تيرودي ل 30 s في ضغط ترويه من 120 مم زئبق.
ملاحظه: يعتمد نجاح التروية جزئيا علي الاستبعاد الكامل للدم من السرير الوعائي - دافق مع محلول البارافورمالدهيد-غلوتارالديهيد في نفس الضغط لمده 10 دقيقه.
ملاحظه: الحفاظ علي ضغط ترويه المستمر أمر ضروري لتجنب إدخال التحف. الاضافه إلى ذلك ، فان درجه الحرارة من perfusate لا ينبغي ان تكون اقل من درجه حرارة الجسم الفئران لتجنب تضيق الاوعيه - أزاله الدماغ الثابت من الجمجمة ومكان في الطازجة بارافورمالدهيد-غلوتارالديهيد مثبت في 4 °c بين عشيه وضحيها.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
2. تشريح المخ
- تضمين الدماغ الثابتة في 4 ٪ اجنشا والغراء كتله الدماغ-اجنشا علي مرحله الذبذبات
ملاحظه: وقد حصلت مختبرات أخرى علي أقسام ذات نوعيه جيده من خلال تحقيق كتله مستقره علي الذبذبات دون دعم أجار - مقطع شرائح من سمك 50 μm. تعيين ميكروتومي إلى التردد المنخفض والسرعة.
ملاحظه: يمكن تخزين الأقسام في 0.1 M PB مع 0.05 ٪ الصوديوم أزيد في 4 درجه مئوية لعده سنوات. - وضع الأقسام في 0.1 M PB في طبق بيتري ، ودراسة الأقسام تحت المجهر تشريح واختيار العينات لتضمين
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
3. الشطف
ملاحظه: من المهم شطف العينة بعد التثبيت مع الديهيديس وقبل التثبيت مع الاوزميوم ، لان المثبتات المتبقية قد تنتج الاوزميوم رواسب
- ماصه 0.1 M PB إلى قارورة زجاجيه قصيرة وواسعة الفم مع غطاء. ضع عينه واحده لكل قنينة. تغطيه كامله للعينه بحيث لا تجف.
ملاحظه: الحفاظ علي العينات في نفس القارورة من هذه الخطوة من خلال جميع التغييرات الحل من التثبيت ، والجفاف والتسلل ، حتى انها مستعدة لتضمين شقه. - شطف العينة في 0.1 M PB لمده 3 دقائق × 2 ، ثم أزاله PB مع ميكروماص.
ملاحظه: منذ الدماغ من الفئران حديثي الولادة حساسة للغاية للتغيرات في الاسموليه12,35,36,37, تنفيذ الغسيل في نفس السيارة كما ان المستخدمة في المخلوط المثبت
4. بعد التثبيت مع الاوزميوم
-
اعداد الاوزميوم تيروكسيد (اوسو4)
ملاحظه: يستخدم مختبر هذا المؤلف اوسو4 4 ٪ المقدمة في محلول مائي في أمبولات زجاجيه (5 مل من اوسو4 4 ٪ في ح2س). وقد استخدمت مختبرات أخرى اوسو4 بلورات بنجاح. ومع ذلك ، عده ساعات ضرورية لأذابه البلورات اوسو4 في السيارة.- خذ 5 مل (أمبوله واحده) من 4 ٪ OsO4/H2O ، فتحه ووضعه في زجاجه الزجاج البني
ملاحظه: اوسو4 هو عامل مؤكسد قوي ويقلل بسهوله عن طريق التعرض للضوء. ويمكن تجنب الحد اثناء التحضير عن طريق وضع اوسو4 في زجاجه الزجاج البني - أضافه 5 مل من 0.2 M PB. وهذا سوف تسفر عن 10 مل من 2 ٪ اوسو4/0.1 M PB.
ملاحظه: منذ الدماغ من الفئران حديثي الولادة حساسة للغاية للتغيرات في osmolarity ، واستخدام نفس المخزن المؤقت لاعداد المثبتات الدهيد و OsO4 الحل12،35،36،37 - أضافه 10 مل اضافيه من 0.1 M PB. وهذا سوف تسفر عن حل نهائي من 20 مل من 1 ٪ OsO4 في 0.1 m PB.
- استخدم حقنه 20 مل مزوده بابره طويلة لرسم 1 ٪ OsO4 ووضعها في زجاجه الزجاج البني أو قارورة scint مغطاه رقائق ألومنيوم.
تحذير: اوسو4 متقلبة للغاية وأبخرها سامه للأنف والعينين والحلق. يجب ان يتم تنفيذ جميع الاعمال في غطاء الدخان باستخدام القفازات والملابس الواقية ، ولا ينبغي ان يتعرض اي جزء من الجسم إلى اوسو4. وينبغي ان يتم المناولة والتخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة الخاصة بك. تخزين الغير المستخدمة OsO4 في زجاجه الزجاج البني باحكام مع بطانة تفلون علي سداده الزجاج ، التفاف الزجاجة في إحباط ألومنيوم مزدوجة وتخزينها في ديسيكاتور. في وجود أبخره تسرب ، يمكن اوسو4 تلطيخ الأسطح الداخلية ومحتويات الثلاجة. تحت ظروف التخزين المذكورة أعلاه الحل اوسو4 مستقره لعده أشهر. عند الحصول علي أكسده الحلول اثناء التخزين ، فانها تتحول الرمادي ، وفي هذه الحالة تحتاج إلى التخلص منها.
- خذ 5 مل (أمبوله واحده) من 4 ٪ OsO4/H2O ، فتحه ووضعه في زجاجه الزجاج البني
- أضافه 1 ٪ OsO4 في 0.1 M PB في قارورة العينة والسماح للجلوس 1 ح. استخراج اوسو4 بعد 1 ح مع ميكروماص.
ملاحظه: قبل تطبيق اوسو4 علي القسم ، من المهم ان تتكشف وتسطيح العينة. تجنب التطبيق مباشره علي الجزء العلوي من العينة ، بدلا من استخدام جدران القارورة لتنقيط بلطف اوسو4 إلى الجزء السفلي من القارورة. العينة يصبح البني وجامده بعد وقت قصير من التطبيق اوسو4 . التعامل برفق من الآن فصاعدا لتجنب تلف الانسجه
5. الشطف
ملاحظه: من المهم شطف العينة بعد التثبيت مع اوسو4 وقبل الجفاف ، لان المثبتات المتبقية قد تتفاعل مع عوامل الجفاف37.
- شطف مع 0.1 M PB لمده 3 دقائق × 3.
ملاحظه: منذ الدماغ من الفئران حديثي الولادة حساسة بعمق للتغيرات في osmolarity ، وتنفيذ الغسيل في نفس السيارة كما ان المستخدمة في الخليط المثبت12،35،36،37. - وضع الحل الاوزميوم وأول اثنين من الرصاص البرميل إلى اوسو4 النفايات والتخلص منه وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة الخاصة بك.
6. الجفاف متسلسلة وتلطيخ مع خلات اليورانيل
ملاحظه: يستخدم مختبر هذا المؤلف راتنجات الايبوكسي المائية لتضمينها. عند استخدام راتنجات الايبوكسي ، يجب استبدال جميع المياه المجانية للعينه بمذيب عضوي قبل التسلل بواسطة الوسط المضمن. تتم أزاله المياه عن طريق تمرير العينة من خلال سلسله من الحلول لتركيزات تصاعدية من الايثانول والأسيتون12.
-
اعداد خلات اليورانيل (UA)
- وضع 200 mL قارورة الزجاج الحجمي التي تحتوي علي 100 mL من EtOH 70 ٪ علي لوحه التحريك.
- أضف 4 غ من UA إلى القارورة. التفاف في رقائق ألومنيوم (UA يعجل عندما تتعرض للضوء) ويحرك باستمرار.
ملاحظه: UA يذوب ببطء وبشكل غير كامل في 70 ٪ EtOH. السماح بلورات غير الذائبة ليستقر قبل استخدام الحل. وينبغي تصفيه UA الحل مع فلتر 0.45 μm قبل الاستخدام. UA يمكن اعدادها في وقت مبكر والاحتفاظ بها في زجاجه البني ملفوفه في رقائق ألومنيوم في 4 درجه مئوية لعده أشهر.
تحذير: UA هو مشع معتدل وشديد السمية. استنشاق مسحوق UA يمكن ان يسبب اضطرابات الجهاز التنفسي العلوي والمرض في الرئتين والكبد والكلي. UA خطره عند بلعها أو عندما يتعلق الأمر في اتصال مباشر مع الجلد والاغشيه المخاطية. يجب ان يتم تنفيذ جميع الاعمال في غطاء الدخان باستخدام القفازات والملابس الواقية. وينبغي ان يتم المناولة والتخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة الخاصة بك.
- ديهيدرات في 50 ٪ EtOH لمده 1 دقيقه. أزاله 50% EtOH قبل أضافه UA.
-
أضافه 4 ٪ UA في 70 ٪ EtOH. اسمحوا الجلوس لمده 1 ساعة أو بين عشيه وضحيها. إذا بين عشيه وضحيها ، مكان في الثلاجة في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: غطاء قارورة لتجنب التبخر EtOH وتغطيه مع رقائق ألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.- التخلص من النفايات UA والاثنين التالية الشطف وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة الخاصة بك
- ديهيدرات في 70 ٪ EtOH لمده 1 دقيقه.
- ديهيدرات في 90 ٪ EtOH لمده 5 دقائق.
- ديهيدرات في 100 ٪ EtOH لمده 5 دقائق × 2.
- شطف العينة في الأسيتون لمده 2 دقيقه × 3.
7. التسلل والتضمين
ملاحظه: الانسجه ليست جامده بما فيه الكفاية ليتم قطعها إلى أقسام رقيقه دون دعم إضافي من مصفوفة الراتنج. لذلك ، يجب ان تسبق التسلل والتضمين12.
-
اعداد الراتنج EPON
- استخدام حقنه أنبوبي 60 mL. أزاله المكبس حقنه وغطاء حقنه مع ابره السلامة.
- ضع الحقنه مع الجانب المفتوح حتى وأضافه حجم كل مكون من مزيج الراتنج تدريجيا. أضافه 22 مل من تضمين-812 (الراتنج). أضافه DDSA (hardener) إلى حجم إجمالي 37 mL. أضافه NMA (hardener) إلى حجم الإجمالي من 50.5 mL. أضافه 525 μL من التفريغ-30 (مسرع) مع ماصه. تحريك المكبس من الماصة ببطء شديد كما ان الكوارث لزج جدا.
ملاحظه: من المهم أضافه الكواشف التضمين بالترتيب المسرود. يجب أضافه المسرع (التفريغ-30) آخر. للحصول علي كتله الشفاء التي لديها الخصائص المطلوبة ، فمن المهم لاستخدام كميه الدقيق من المقوي والمسرع. يتم تفضيل الخلطات المضمنة الطازجة. - وضع المكبس مره أخرى ووضع الحقنه علي الروك مع الاهتزاز المستمر لمده 30 دقيقه علي الأقل. سيتغير اللون من الأصفر إلى العنبر.
ملاحظه: يجب ان تكون مختلطة جميع المكونات جيدا جدا. الفشل في القيام بذلك يؤدي إلى التشريب متفاوتة من عينه الانسجه وكتله من صلابة متفاوتة
- مزيج 1 حجم من راتنج EPON مع 1 حجم الأسيتون في قارورة scint ويهز لخلط. تطبيق 1:1 EPON: خليط الأسيتون علي النسيج بعد أزاله الأسيتون الماضي شطف. يحفظ مغطي لتجنب تبخر الأسيتون. أزاله خليط 1:1 من الراتنج والأسيتون بعد 2-4 h أو الاحتفاظ بين عشيه وضحيها.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - استبدال خليط من الراتنج والأسيتون مع الراتنج الكامل. دعوانا نجلس لمده 4 ساعات أو بين عشيه وضحيها. وضع جميع النفايات EPON في حاويه جمع تحت غطاء محرك الشاحنة ليتم بلمره والتخلص منها في وقت لاحق.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
8. شقه--تضمين
ملاحظه: العينات هي مسطحه-جزءا لا يتجزا بين اثنين من الأفلام aclar في الأزياء مثل شطيرة.
- قطع قطعتين مستطيله من ورقه aclar واضحة. مسح الأفلام نظيفه مع EtOH 70 ٪. تقليم الأوراق بحيث يكون هناك ما لا يقل عن 1.5 سم من البلاستيك الخالي من الانسجه علي كل جانب من القسم. ورقه aclar علي اعلي يجب ان يكون لها نفس العرض كما في الجزء السفلي ، وينبغي ان يكون ارتفاعه ما يقرب من ثلثي ورقه أسفل.
- أماله ببطء القارورة مع العينة ورفع بلطف الانسجه من الجزء السفلي من القارورة.
- استخدام ملعقة صغيره مرنه وفرشاه غرامه لنقل القسم بعناية علي طول الجدران قارورة ونقلها إلى ورقه aclar.
ملاحظه: التعامل مع الأقسام بحذر لتجنب الضرر العينة. - ضع برفق ورقه aclar علي راس العينة.
ملاحظه: تاكد من وجود ما يكفي من الراتنج بين ورقتين لختم ساندويتش - دفع بلطف من اي فقاعات الهواء المحاصرين دون ممارسه الضغط المباشر علي القسم. القضاء علي EPON الزائدة.
ملاحظه: القضاء علي فقاعات الهواء مهم ، حيث ان وجودها يجعل التصور من العينة صعبه ويضعف استقرار السندات الراتنج. - تسميه الأوراق مع قلم مقاومه المذيبات ومكان في الفرن في 60 ͦC لمده 2-3 أيام لتتبلمر.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
9. كبسوله التضمين
ملاحظه: يتم تزويد ultramicrotomes مع الرمي لعقد كتل اسطوانيه التي تم الحصول عليها من تضمين العينات في كبسولات. الكتل الاسطوانيه لديها الهندسة المثالية لتكون اقل تاثرا بالاهتزازات الناشئة اثناء التقطيع.
- افتح برفق الأفلام المحصورة. سوف العينة التمسك واحده من اثنين من صحائف aclar.
- استخدم قلم مقاوم لمذيبات لوضع علامة علي جانب ورقه aclar التي تحتوي علي القسم. مارك بالقرب من النسيج.
ملاحظه: من المهم لتنفيذ هذه الخطوة قبل اللكم الانسجه من الفائدة. - استخدام لكمه القرص للحصول علي عينه دائره من القسم. يجب ان تكون علامة القلم جزءا من الانسجه المثقوبة.
- جهز غطاء كبسوله التضمين علي حامل الكبسولة. ضع قطره من الراتنج علي الغطاء.
- ضع القرص المثقب داخل الغطاء مع القسم النسيجي المواجه. ستكون علامة القلم براقه عندما يكون الضوء مطفا علي العينة.
- ادراج كبسوله في الغطاء واستخدام ملاقط غرامه لادراج وضع العلامات. لفه وخفض قطعه مطبوعه 2 سم-طويلة من الورق في الكبسولة. جعل التسمية لتتناسب مع انحناء الجدران الجانبية للكبسولة. انتظر حتى تكون البلمره كامله ، بحيث تصبح التسمية مضمنه بشكل دائم في الراتنج.
- صب الراتنج التضمين داخل الكبسولة وملء حتى حافه الكبسولة.
- دفع عينه الانسجه وصولا إلى الجزء السفلي من الكبسولة مع المعونة من عصا خشبيه مدببه ومكان في الفرن في 60 درجه مئوية لمده 2-3 يوما.
ملاحظه: الحرص علي عدم الضغط علي الانسجه من الصعب جدا ، والسماح لها بدلا من ذلك تكمن فضفاضة بحيث طبقه رقيقه من الوسط التضمين موجودة بين الانسجه وسطح الكبسولة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
10. تقليم الوجه كتله
ملاحظه: صغيره الحجم والشكل المناسب للوجه كتله هي الشروط المسبقة للتماس مرضيه. ولذلك ، وتقليم كتله عينه هو ضرورة.
- استخدم شفره حلاقه حاده ذات حافه واحده. نظفه بالأسيتون قبل الاستخدام مباشره.
- جبل كتله كبسوله في حامل كتله ووضع حامل كتله علي خشبه المسرح من الفراغية.
ملاحظه: يجب ان يتم اجراء التشذيب تحت مناظير المجهر والاضاءه المائلة. - أزاله ورقه aclar من غيض من الكبسولة باستخدام شفره الحلاقة. تظهر ورقه aclar كطبقه لامعه تحت ضوء نطاق تشريح.
- عقد شفره الحلاقة في زاوية من 45 درجه مئوية وجعل التخفيضات إلى أسفل أربعه جوانب من كتله كبسوله.
ملاحظه: ويتحقق التحكم الأفضل في التشذيب إذا تم عقد النصل بكلتا يديه. - جعل التخفيضات القصيرة بحيث ياخذ كتله شكل هرم قصير مع زوايا الجدار من حوالي 45 درجه مئوية.
ملاحظه: ويدعم الوجه عينه أفضل بكثير إذا تم الاحتفاظ الجانبين المؤدية اليها قصيرة. إذا كان الطرف كتله رقيقه جدا وطويلة ، وسوف يهتز اثناء التقطيع رقيقه. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان تتركز منطقه الاهتمام في وجه كتله. - تقليم غيض من الكبسولة للتخلص من الانسجه زائده عن اللزوم والحفاظ فقط علي منطقه الاهتمام.
ملاحظه: لا ينبغي ان يكون جزء من القسم دون الانسجه ، والاختلافات في كثافة الوجه كتله هي سبب رئيسي لصعوبة في التماس. من الناحية المثالية ، يجب ان تكون المساحة السطحية لوجه الكبسولة أكثر من 1 مم2. - تقليم وجه الكبسولة في شكل شبه منحرف scalene. لأنه في شبه منحرف scalene اي جانب يساوي ، هذا الشكل هو الأفضل لتوجيه منطقه الفائدة بالنسبة لبقية العينة.
ملاحظه: اثناء التقسيم ، يتم دعم الوجه شبه المنحرف علي شكل أفضل بكثير من اي شكل آخر.
11. ميكروتومي التماس
ملاحظه: الاغلبيه من عينات احيائيه جدا سميكه في حالتهم طبيعيه ان يكون اخترقت بشعاع الكترون. لذلك ، يجب قطع المواد في المقاطع الرقيقة التي يمكن اختراقها من قبل شعاع الكترون.
- قطع رقيقه المقاطع (لون التداخل الفضة ، 600-900 Å) علي ultramicrotome في الطائرات موازيه للسطح.
- ضع الأقسام علي الشبكات. يستخدم مختبر هذا المؤلف شبكات نحاسية من 3.05 مم في القطر الخارجي.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
12. بعد تلطيخ مع خلات اليورانيل
- اعداد 2 ٪ UA في الماء المقطر. وضع 200 mL قارورة الزجاج الحجمي التي تحتوي علي 100 مل من الماء المقطر علي لوحه التحريك. أضف 2 غ من UA إلى القارورة. التفاف في رقائق ألومنيوم (UA يعجل عندما تتعرض للضوء) ويحرك باستمرار.
ملاحظه: وللاطلاع علي تفاصيل التحضير لتعميم المعلومات ، انظر الفرع 6 من هذا البروتوكول. - ضع عده قطرات فرديه من 2 ٪ UA علي ورقه نظيفه من شمع الأسنان في طبق بيتري.
- تعويم الشبكة مع عينه (قسم الجانب أسفل) علي قطره من UA لمده 25 دقيقه.
ملاحظه: تعويم كل شبكه علي قطره منفصلة من UA. - عقد الشبكة علي حافته مع ملقط وشطف مرتين تحت طائره لطيف من الماء المقطر المغلي في درجه حرارة الغرفة من زجاجه غسل البلاستيك.
ملاحظه: لا تسمح للشبكة لتجف قبل تلطيخ مع الرصاص.
13. بعد تلطيخ مع الرصاص
- اعداد غرفه2-الحرة (co2 في الهواء هو المصدر الرئيسي لهطول الامطار الرصاص). ضع قطعه من ورق الفلتر غارقه مع 1 N NaOH في طبق بيتري. وضع ورقه صغيره من الشمع الأسنان نظيفه علي راس ورقه فلتر ووضع عده الكريات NaOH علي جانب واحد من الطبق. غطي الصحن.
ملاحظه: اعداد هذا الاعداد قبل الملونة الشبكات مع UA ، بحيث الغلاف الجوي في الغرفة خاليه من CO2 وعلي استعداد لتلطيخ الرصاص بحلول الوقت الانتهاء من تلطيخ ua. - جعل 4 ٪ NaOH. أضافه 0.2 غرام من NaOH إلى 5 مل من الماء المقطر.
- اعداد الحل الثلاثي الرصاص ساتو. لاعداد 10 مل ، أضافه 0.1 غرام من نترات الرصاص ، 0.1 غرام من سيترات الرصاص ، 0.1 غرام من خلات الرصاص و 0.2 غرام من سيترات الصوديوم في زجاجه. أضافه 8.2 مل من الماء المقطر ويهز بقوة لمده 5 دقائق. سوكاتي ل 30 ثانيه ، ثم أضافه 1.8 مل من الطازجة 4 ٪ NaOH.
- وضع عده قطرات من الرصاص ساتو علي الشمع في طبق بيتري.
- وضع الشبكة ملطخه UA (قسم الجانب أسفل) علي قطره من الرصاص.
ملاحظه: يجب ان يتم طرح كل شبكه علي قطره منفصلة من الرصاص. يجب ان يكون كل قطره صغيره بما يكفي للسماح للشبكة لتطفو علي راس قبة القطرة بدلا من الانزلاق إلى أسفل علي الجانبين. - غطي الطبق واتركيه لمده 5 دقائق.
- عقد الشبكة في حافته مع ملقط ويغسل جيدا تحت طائره لطيف من الماء المقطر المغلي في درجه حرارة الغرفة من زجاجه غسل البلاستيك.
- لطخه جافه الشبكة علي ورق الترشيح وتخزين الشبكة.
ملاحظه: تاكد من ان القسم لا ياتي في اتصال مباشر مع ورقه الفلتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد وضعت معايير عامه مقبوله في معظمها بوصفها مؤشرا علي الحفظ المرضي أو المعيب للعينه الخاصة بالعينة. وتتمثل هذه المعايير في أربعه الكترونات المجهرية المختارة (مثالين علي التحضير الأمثل ، وهما مثالان علي اعداد معيبه) التي تم الحصول عليها من خلال علاج انسجه المخ الفئران الشباب اتباع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول.
وبشكل عام ، يظهر ميكروغراف الكترون جيد النوعية كصوره منظمه ومتميزة وشامله. في عينه أعدت بشكل مرض ، ينبغي ملء المسافات بين الاغشيه مع المواد الحبيبية ، وينبغي ان لا تكون فارغه. المثل ، لا توجد أماكن فارغه في المادة الارضيه السيتوبلازمية أو داخل الأرغن (قارن الشكل 1 الف والشكل 2 الف مع الشكل 3 والشكل 4). ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان الجهاز العصبي المركزي للحيوانات الصغيرة جدا يظهر درجه معينه من توسيع المساحات خارج الخلية بالمقارنة مع الدماغ الكبار ، مع اتصالات أكثر مرونة بين الخلايا وأكثر بياضا عموما ، واقل الكترون الكثيفة المظهر. يجب ان تكون الاغشيه مستمرة ، دون تشويه أو كسر (الشكل 1a والشكل 2a). يجب ان تظهر سدي الميتوكوندريا موحده وكثيفه ، مع عدم وجود مسافات فارغه. يجب ان يكون cristae سليمه وغير منتفخة ، وينبغي ان يكون الغشاء الخارجي الميتوكوندريا المزدوج غير منقطعة (مقارنه الشكل 1A مع الشكل 3). لتسهيل التحليل الشكلي لتنظيم الحويصلة قبل المتشابك ، يجب ان تكون الاغشيه قبل وبعد المتشابك سليمه وموازيه بشكل أساسي لبعضها البعض (انظر الشكل 1). وينبغي ان تكون الحويصلات متشابك يمكن تتبعها وملزمه بغشاء واحد مستمر (انظر الشكل 2).
الأهم من ذلك ، حتى عندما يتم اتباع أفضل الممارسات ، وعلاج العينة مع المثبتات ، والبقع والراتنجات يقدم التحف. منذ القطع الاثريه لا يمكن القضاء عليها ، فمن المهم ان نفهم ما هي العملية التي تنشا منها ، بحيث يمكن تفسير مظهر العينة فيما يتعلق بالعلاج الذي خضع12. مثال علي قطعه أثريه-بين عده التي يمكن إنشاؤها اثناء اعداد العينات لل TEM-هو الرقم المايلين ، وهو ادراج غشائي لاميلار التي تشبه المروج المايلين. علي الرغم من ان الأرقام المايلين يمكن ان ينظر اليها في الظروف المرضية12، وغالبا ما تنجم عن استخراج الدهون الغشاء اثناء التثبيت مع الديهيديس (انظر الشكل 4).
الشكل 1: ممثل الكترون المجهري للحفاظ علي بنيه الخلية بصوره مرضيه (المثال 1). (ا) اغشيه الخلايا العصبية الطبقات ودون فواصل. السيتوتوبلاسما الحبيبية ناعما وبدون مسافات فارغه. الميتوكوندريا ليست منتفخة ولا تقلصت. يتم حفظ الغشاء المزدوج الخارجي ، والكريستاي الداخلية سليمه. (ب) تفاصيل الفريق ا ، نموذجا لطريقه واحده لقياس المسافة من الحويصلات متشابك من الغشاء قبل متشابك. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ممثل الكترون المجهري للحفاظ علي بنيه الخلية بصوره مرضيه (المثال 2). (ا) حويصلات متشابك متميزة ومبطنه بغشاء واحد غير منقطع. للسماح بالتحليل الشكلي لتوزيع الحويصلة المتشابكة ، يجب ان تكون الاغشيه قبل المتشابك وما بعد التشابك متوازية والحفاظ علي استمراريتها. (ب) تفاصيل الفريق ا ، نموذجا لعد الحويصلات متشابك داخل المحطة قبل متشابك. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ممثل الكترون المجهري للحفاظ علي بنيه الانسجه المعيبة (مثال 1). لاحظ تشويه وكسر اغشيه الخلايا العصبية ووجود المساحات خارج الخلية الموسعة بشكل ملحوظ (ملحوظ مع *). الميتوكوندريا تظهر منتفخة ولها كريستاي تورم (ملحوظ مع السهم). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ممثل الكترون المجهري للحفاظ علي بنيه الانسجه المعيبة (مثال 2). لاحظ وجود مساحات بيضاء كبيره فارغه داخل السيتوبلاسما (ملحوظ مع ǂ) ، بدلا من ماده سيتوبلازمية الحبيبية ناعما. تظهر المساحات خارج الخلية الموسع. يتم وضع علامة علي غشائي دوار (الشكل myelin) ، والتي يرجح ان تنجم عن تعبئة الدهون اثناء التثبيت مع غلوتارالديهيد ، مع اختصار MF. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعامل مع أقسام الانسجه اثناء اعداد العينات لل TEM يتطلب درجه كبيره من البراعة والتركيز والصبر. عند استخدام الماصات المجهرية لأضافه المحاليل وأزالها ، يمكن امتصاص العينات في طرف الماصة عن طريق التوتر السطحي ، لذا ينبغي توخي الحذر الشديد لتجنب تلف الانسجه بواسطة الماصة. أيضا ، خطوات معينه من تسلسل الجفاف يمكن ان تكون سريعة 1 دقيقه ، التالي المشغل يحتاج إلى العمل بسرعة لضمان ان الخطوة التالية الجفاف بدات في الوقت المحدد والعينة لا تجف أو تجعد. واحد الاجراء الذي يتطلب اهتماما خاصا هو بعد التثبيت مع الاوزميوم. أقسام تصبح جامده بعد العلاج مع الاوزميوم ويمكن ان تتلف بسهوله. قبل أضافه الاوزميوم ، فمن الضروري ان يتم تسطيح الأقسام في الجزء السفلي من القارورة ، والا فان اي اضعاف يؤدي إلى كسر الانسجه. التعامل مع الانسجه التي يتم التحكم فيها صعبه بشكل خاص عند نقل المقاطع إلى أفلام aclar لتضمينها في الشقة. وهناك حاجه إلى رعاية خاصه عند رفع العينة من الجزء السفلي من القارورة لتجنب التجزؤ ، وعند دفع فقاعات الهواء من ساندويتش الفيلم. في حين انه من المهم لدفع اي الهواء المحاصرين ، كما انه يجعل التصور من العينة الصعبة ويضعف استقرار السندات الراتنج ، والضغط المباشر علي الانسجه اوسميتيد يمكن بسهوله إلحاق الضرر. ومن الخطوات الأخرى التي تستلزم رعاية اضافيه اعداد خليط الراتنج لتسلل العينات وتضمينها. Epon ، والأكثر استخداما علي نطاق واسع الراتنج التضمين ، يمكن ان تصلب مع أضافه تصليب ومسرع. فمن المحتم استخدام كميه دقيقه من المقوي والمسرع من أجل الحصول علي كتله الشفاء مع الخصائص المطلوبة. وقد تم وصف كل من الطرق الوزنية والحجمية لقياس الراتنجات اللزجة. علي الرغم من ان الطرق الوزنية كانت تعتبر تقليديا أكثر دقه12، وقد حققت مختبر هذا المؤلف نجاحا جيدا مع وسائط الحجمي (اي ، أضافه حجم كل مكون من مزيج الراتنج تدريجيا عن طريق حقنه غاجي) . بعد ان تم قياس مكونات الراتنج بعناية ، فانها يجب ان تكون مختلطة تماما لتحقيق التشريب موحده ، لأنها تمتلك الفضول مختلفه ومعدلات البلمره. والفشل في تحقيق خلط كامل يؤدي إلى كتله من صلابة متفاوتة غير مناسبه لتقطيع رقيقه.
التغييرات الملحوظة في قوه انقباض من الحلول المستخدمة لمعالجه المقاطع من الدماغ الفئران الشباب يمكن ان يسبب انكماش و/أو تورم في الفضاء خارج الخلية والمكونات الخلوية12,35,36,37 . اثناء التثبيت ، يتم الحصول علي أفضل النتائج عندما يتم الاحتفاظ الضغط الاسموزي من perfusate مماثله قدر الإمكان لتلك الانسجه تحت الدراسة. [اوسمولليتي] دماغ فاره تقريبا 330 [مورم]. A 2% غلوتارالديهيد في 0.1 M PB الحل هو فقط فرط قليلا (400-450 mOsm) ويقلل من التوسع في الفضاء خارج12. ولا سيما ، تظل الاغشيه حساسة للتغيرات في الضغط الاسموزي لمحاليل الشطف والجفاف بعد التثبيت مع الديهيديس. ولذلك ، من المهم أيضا التقليل إلى ادني حد من الاختلافات بين الاسموليه المثبت والحلول المستخدمة في وقت لاحق12،35،36،37. لهذا السبب ، يتم استخدام نفس السيارة (0.1 M PB ، تقريبي الاسموليه 440 mosm) كمذيب لجميع الحلول في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، تجدر الاشاره إلى ان العديد من المخازن المؤقتة المختلفة قد استخدمت بنجاح اثناء اعداد العينات ل TEM ولا يمكن للمخزن المؤقت الواحد المطالبة بالتفوق العالمي علي الآخرين. عندما يفضل المخازن المؤقتة لأقل النغمات ، وقد اختارت مختبرات أخرى لزيادة الاسموليه مع الشوارد أو غير الشوارد12.
تتطلب عده خطوات في هذا البروتوكول استخدام المواد الكيميائية التي يمكن ان تكون سامه عندما لا تتم معالجتها بشكل صحيح. ولا يمكن المبالغة في اهميه العمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية اثناء مناوله الديهيديس والاوزميوم واليورانيوم ومركبات الرصاص. في حين ان النظم اليه المتناقضة يمكن ان تساعد علي تخفيف بعض المخاطر ومتاحه تجاريا ، فانها يمكن ان تكون مكلفه جدا وقد لا تكون بأسعار معقولة من قبل المختبرات التي لا تجعل الاستخدام الروتيني لل TEM. علي الرغم من ان مختبر المجهر الكترون يمكن ان يكون مكانا خطرا ، ومعالجه العينات لل TEM أمنه عموما عندما يتم تنفيذها بصرامة.
في الاونه الاخيره ، وإدخال المجهر الضوئي فائقه الدقة زادت التصوير البصري حل السلطة إلى حوالي 15 نانومتر34. ومع ذلك ، عندما يكون الهدف هو اجراء تحليل مورفمتري من التنظيم المكاني لحويصلة متشابك في محطات ما قبل متشابك ، لا يوفر تقنيه نفس الدرجة من التفاصيل المورفولوجية. والاهم من ذلك ، ان TEM محدود بالحاجة إلى ان تكون العينة ميتة قبل ان تتم معالجتها وتصورها. ولذلك ، عندما يكون هدف الدراسة هو التحقيق في الجوانب الديناميكية أو الوظيفية من الاتجار بالحويصلات المتشابكة وندره المحببات ، ينبغي النظر في أدوات أخرى غير TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه المخطوطة من قبل المعاهد القومية للصحة/NIGMS K08 123321 (إلى N.L.) وباموال من قسم التخدير في جامعه فيرجينيا. ويود المؤلفون ان يشكروا السيد ايليف (قسم علم الاحياء ، جامعه فرجينيا ، شارلوتسفيل ، VA) علي التدريب الممتاز والمساعدة التقنية مع TEM ، وعلي انتقاداتها التي لا تقدر بثمن. ويشكر المؤلفون أيضا مرفق المجهر الكتروني المتقدم في جامعه فرجينيا للحصول علي المساعدة التقنية مع العينات والتقطيع وما بعد التلطيخ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).
- Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
