כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להכין thymocytes, מקרופאגים הצפק ולנתח את היעילות של efferocytosis ואת החסימה בתיווך מעכבי של האפוטוציטים thymocytes שתבלע. פרוטוקול זה יש יישום נרחב בסיווג התא-תיווך של חלקיקים אחרים כולל חרוזים מלאכותיים וחיידקים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים
במאמר זה
סיכום
תקציר
ואפופטוזיס תא הוא תהליך טבעי וממלא תפקיד קריטי בפיתוח עובריים, רגולציה הומסטטית, עמידות החיסונית אינדוקציה, ורזולוציה של דלקת. הצטברות של פסולת אפוטוטית בגוף עלולה לגרום לתגובות דלקתיות כרוניות המובילות מחלות אוטואימוניות מערכתית לאורך זמן. . מעורב במגוון מחלות אוטואימוניות סיווג האפוטוטיק הוא תהליך מורכב שנדיר לעתים רחוקות בתנאים פיזיולוגיים. זה כולל קולטני שטח שופע מולקולות איתות. לימוד התהליך של הסיווג התא האפוטוטיק מספק מנגנונים מולקולריים תובנה ותגובות ביולוגיות עוקבות, אשר עשוי להוביל לפיתוח של therapeutics חדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור אינדוקציה של thymocytes האפוטוציטים, הכנת מקרופאגים הצפק, וניתוח של הסיווג התא האפוטוטיק על ידי הזרמת cy, ומיקרוסקופ. כל התאים יעברו אפופטוזיס בשלב מסוים, ומגורים רבים במחזור התאים יכולים ספיגה של פסולת אפוטוטית. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין את כריכת התא האפוטוטית ובליעה של סוגים רבים של תאים אחרים.
מבוא
הגוף שלנו מייצר 1-10 מיליארד תאי האפוטוטיים על בסיס יומי. מספר גדול של תאים אפוטוטיים חייב להיות מתנקה באופן שהתגובות החיסונית יישארו בשקט. כדי להבטיח את הסיווג של תאים האפוטוטיים בזמן, סוגים רבים של תאים תושב רקמות ותאים מחזורי לפתח מנגנונים לתאי האפוטוטיים מפרץ1. רגולציה מתפקדת של אפופטוזיס כבר מעורב בתחילתה והתקדמות של מחלות דלקתיות שונות החסינות האוטומטית2. אפופטוזיס גם משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של התפתחות הסרטן ההתנגדות הבאה שלה טיפולים קונבנציונליים3,4. הסרת תאים אפוטוטיים מקדמת בדרך כלל תגובה אנטי דלקתית, אשר עשויה להיות מקושרת לסובלנות החיסונית
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עכברים ניסיוניים התרבו והחזיקו במושבת העכברים שלנו. כל העבודות בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי.
1. הכנת תימוציטים מותווית של CFSE
- המתת חסד שני העכברים C57/B6 על ידי CO2 שאיפת עבור 10 דקות ולנתח כדי לפתוח את חלל החזה, להסיר (למשוך החוצה) את התימוס עם מלקחיים בסדר מעוקל עצה לתוך צלחת התרבות הרקמה פטרי המכיל 10 מ ל של RPMI1640 medium.
- השג השעיה תא יחיד על ידי שיוף התימוס כולו נגד שני קצוות מזוגג של שקופיות מיקרוסקופ ולאחר מכן לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 100 יקרומטר.
- לאסוף את 10 מ"ל בלוטת התימוס הבולם לתוך צינור 50 mL ו צנטריפוגה ב 300
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתוח של מקרופאג הצפק-מתווך של האפוטוציטים. מקרופאגים הצפק ותאי האפוטוטיק היו מוכנים ושיתוף תרבותי כפי שמתואר בפרוטוקול. מקרופאגים היו מנותקים ומוכתמים עם הנוגדן PE anti-CD11b באוב עבור 20 דקות על הקרח. מקרופאגים נשטפו לאחר מכן ועובדו באמצעות ציטוטומטר זורם. כפי שנראה, אין CFSE חיובי מקרופאג ברביע הימני התחתון כאשר לא נוספו תאים האפוטוטיים לתוך התרבות (איור 1A ואיור 2, הפאנל הראשון). ליוגליל-מקרופאגים בצפק ממריצים יש את הקיבולת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אפופטוזיס הוא תהליך שימור מאוד תאים מוות המערבת הרבה אותות מפלי ומשרה ביטוי חלבון, הפרשה, ותחבורה. אפופטוזיס קשורה לעיתים קרובות עם שינויים מורפולוגיה הסלולר17. תאים אפוטוטיים משחררים ציטוקינים ונוגדנים שמושכים phagocytes כדי לעבור לאתר וליזום את תהליך של שריפת, מסלול מורכב מאוד תחת שליטה הדוקה18. מצד שני, מוות תאי נקרוטי משחרר אותות סכנה המפעילים תגובות דלקתיות1. הסיווג פגום או ממושך של תאים אפוטוטיים יוביל לנמק משני של תאים אלה19<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
מחקר במעבדת האלה נתמך על ידי מחקר של פרס חדשני של המכללה לרפואה ואת הפרס טייס הפקולטה זוטר מהמחלקה לרפואה פנימית, אוניברסיטת סינסינטי וגרנט DK K01_095067 מ NIDDK/NIH.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מאגר ליזינג Ack | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| נוגדן נגד Mer | R& D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (שיבוט M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 מ"מ) | GIBCO | 15575-020 | |
| צינורות FACS | BD Biosciences | 352017 | |
| שקופיות חלביות | פישר סיינטיפיק | 12-552-343 | |
| סרום סוסים (מנוטרל בחום) | Invitrogen | 26050088 | |
| לידוקאין | סיגמא-אולדריץ' | L-5647 | הכן מאגר 1% ב-1x PBS |
| PBS, 1x | קורנינג | 21040CV | |
| RPMI-1640 | קורנינג | 10040CV | |
| RXDX-106 | סלק כימיקלים | CEP-40783 | |
| סטאורוספרין (100 מ"ג) | פישר סיינטיפיק | BP2541-100 | הוסף 214.3 מ"ל של DMSO לתוך 100 מ"ג להכנת תמיסת גרב של 1 מ"מ |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | הכן 3% מאגר תיוגליקולט ב-1&cute; PBS, חיטוי, ומאחסנים בחושך למשך 3 חודשים. |
מקורות
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
