Summary
O micro tomography computado do raio X é eficaz em obter a informação tridimensional dos espécimes humanos não danificados mas tem o sucesso limitado em observar os tecidos macios. O uso do agente do contraste do ácido fosfotúngstico pode resolver esta edição. Nós implementamos este agente do contraste para examinar tecidos fibromusculares delicados humanos (o ligamento de retenção dos orbicularis).
Abstract
A dissecção manual e a observação histológica são métodos comuns usados para investigar tecidos humanos. Entretanto, a dissecção manual pode danificar estruturas delicadas, quando o processamento e a observação histológica fornecerem a informação limitada com a imagem latente transversal. O micro tomography computado do raio X (microCT) é uma ferramenta eficaz para obter a informação tridimensional sem danificar espécimes. Entretanto, mostra a eficiência limitada em diferenciar partes macias do tecido. O uso de agentes que melhoram o contraste, como o ácido fosfotúngstico (PTA), pode resolver este problema melhorando o contraste do tecido macio. Nós implementamos o microCT com o PTA para investigar o ligamento de retenção do orbicularis humano (ORL), que é uma estrutura delicada na área da órbita. Neste método, os espécimes colhidos são fixados em formalina, desidratados em soluções de etanol serial, e coradas com uma solução de PTA. Após a coloração, a varredura de microCT, a reconstrução 3D, e a análise são executadas. A pele, os ligamentos, e os músculos podem claramente ser visualizados usando este método. O tamanho da amostra e a duração da coloração são características essenciais do método. A espessura adequada do espécime foi de cerca de 5 – 7 mm, acima da qual o processo foi retardado, e a duração ótima foi de 5 a 7 dias, abaixo do qual um buraco vazio na área central ocasionalmente ocorreu. Para manter a localização e a direção de peças pequenas durante o corte, é recomendável costurar na mesma região de cada peça. Além disso, análises preliminares da estrutura anatômica são necessárias para identificar corretamente cada peça. Parafilm pode ser usado para impedir a secagem, mas o cuidado deve ser tomado para impedir a distorção do espécime. Nossa observação multidirecional mostrou que o ORL é compor de um malha multicamada de placas contínuas, um pouco do que a fio-como fibras, como relatado previamente. Estes resultados sugerem que a varredura de microCT com PTA seja útil para examinar compartimentos específicos dentro das estruturas complexas do tecido humano. Pode ser útil nas análises de tecidos de câncer, tecidos nervosos e vários órgãos, como o coração e o fígado.
Introduction
A dissecção manual e a observação histológica são tipicamente usadas para examinar os tecidos humanos, como músculos e tecidos conjuntivos. No entanto, a dissecção manual pode facilmente danificar estruturas delicadas, e a observação histológica fornece informações limitadas sobre superfícies planas transversais1,2. Portanto, métodos melhorados são necessários para examinar os tecidos de forma mais precisa e eficiente.
A tomografia computadorizada convencional (TC) é geralmente utilizada na prática clínica, mas carece da capacidade de distinguir pequenas estruturas2,3. O micro raio X CT (microCT) é uma ferramenta eficaz para obter a informação tridimensional (3D) de estruturas pequenas dos espécimes, sem destruí-los. Entretanto, microCT tem aplicações limitadas porque somente os tecidos densos podem ser visualizados claramente; Ele não pode ser usado para diferenciar os tecidos moles. Para superar esta limitação, os agentes de coloração podem ser usados. Os agentes que melhoram o contraste, como o ácido fosfotúngstico (PTA), o ácido foshomolíbdico e o iodo de Lugol, melhoram a taxa de contraste dos tecidos moles durante a digitalização4,5. Vários estudos comparando esses agentes sugerem que a PTA demonstra bom desempenho e é de fácil manuseio6,7,8.
O ligamento de retenção de orbicularis (ORL) é uma estrutura delicada em torno da órbita, que pode facilmente ser danificada durante a observação convencional9. Nós examinamos e recuperado com sucesso a informação 3D nesta estrutura usando microCT com o PTA como um agente do contraste. Este método pode ser aplicado a estudos sobre outros tecidos humanos, como o coração e o fígado, com modificações apropriadas10,11,12.
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Protocol
Todos os cadáveres utilizados neste estudo foram legalmente doados ao centro de educação em anatomia cirúrgica da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei.
1. obtenção de amostras
- Desenhe uma linha de incisão no cadáver com um lápis colorido para indicar a área de corte para a colheita da amostra. Verifique se a linha de incisão desenhada se estende medialmente a um canthus medial, lateralmente a um canthus lateral, superiormente a uma borda superior da pálpebra inferior, e inferiormente a 1 cm abaixo da linha da borda orbital.
Nota: considere o tamanho da amostra com base no tamanho máximo de digitalização do equipamento Micro-CT (nosso equipamento poderia adquirir uma imagem com uma dimensão de objeto máximo de 7 × 7 cm). Aqui, uma amostra de aproximadamente 1 cm de largura, 3 cm de comprimento e 1,25 g de peso foi colhida da região ORL. - Corte os tecidos faciais seguindo a linha da incisão com uma lâmina. Certifique-se que o corte é profundo de tal forma que a ponta da lâmina toca o osso. A amostra deve incluir a pele, o tecido subcutâneo, o músculo, a gordura e o periósteo.
- Fixar a amostra em formalina a 10% imediatamente e conservá-la durante 5 a 7 dias à temperatura ambiente (Figura 1a).
Nota: os cadáveres embalsamados e frescos podem ser usados para este estudo. No entanto, a solução de fixação para cadáveres pode diferir ligeiramente da solução utilizada em um experimento biológico. Portanto, sugerimos a fixação da amostra com formalina a 10% novamente, mesmo após a obtenção da amostra de cadáveres embalsamados.
2. preparação para a coloração
- Após a fixação, corte a amostra em 3 peças (5 – 7 mm de espessura). Não perca a localização e a direção de cada peça durante este processo.
Nota: o scanner microCT que usamos pode cobrir um tamanho máximo de 7 cm ³, mas a solução PTA não pode penetrar a amostra com sucesso se for muito grossa. - Costurar o lado superolateral de cada peça com uma agulha e uma rosca preta de forma a que a direcção da amostra possa ser verificada mais tarde.
- Deshidratar a amostra em uma série de 30%, 50%, e 70% soluções de etanol para 1 dia cada.
- Coloque a amostra em 70% de etanol até a coloração.
3. preparação para a PTA
- Comece o processo de coloração PTA 1 semana antes da digitalização microCT está agendada.
- Prepare 210 mL de solução de etanol 70% e adicione 2,1 g de poder de PTA a ele. Misture bem usando uma coqueteleira a 55-60 RPM.
Nota: a concentração da solução PTA deve ser de 1% em etanol. - Prepare recipientes de plástico de 3 70 mL para cada peça cortada. Preencha os recipientes com a solução PTA. Mergulhe os espécimes nos recipientes e coloc os em um abanador para a penetração eficaz. Deixar as amostras por 5 – 7 dias (Figura 1b).
- Quando a coloração for concluída, armazene a amostra em 70% de etanol para se preparar para a digitalização.
Nota: as amostras manchadas podem ser mantidas por vários meses, mas é recomendável que as amostras sejam escaneadas o mais rápido possível para garantir a coloração completa.
4. digitalização MicroCT
- Enrole a amostra com parafilm para evitar a secagem. Não enrole as amostras muito apertadas, pois isso pode levar à deformação.
- Abra o scanner e coloque a amostra na bandeja (Figura 2).
- Defina os parâmetros de digitalização da seguinte forma: tensão de fonte (kV) = 70, corrente de fonte (μA) = 114, filtro Al = 0,5 mm, tamanho de pixel de imagem (μm ²) = 20, pixels = 2240 × 2240, exposição (MS) = 500, etapa de rotação (DEG) = 0,3.
Nota: os parâmetros podem ser modificados de acordo com as amostras e/ou scanners utilizados. - Inicie a digitalização.
Nota: a digitalização demora de 30 a 60 min, dependendo da resolução pretendida e da velocidade do scanner.
5. reconstrução e otimização de dados
- Execute o software de reconstrução. Selecione abrir conjunto de dados no menu ações para iniciar os arquivos digitalizados.
- Selecione a guia configurações na janela reconstrução . Defina os parâmetros da seguinte forma: redução de artefatos de anel = 7, correção de endurecimento de feixe (%) = 40.
Nota: os parâmetros podem ser modificados de acordo com a amostra. - Comece a reconstrução selecionando Iniciar na guia Iniciar . Os dados finais serão armazenados na pasta designada.
- Execute o software de redimensionamento de arquivos. Selecione o conjunto de dados de origem para iniciar os arquivos reconstruídos.
- Selecione jpg na guia conjunto de dados de destino .
- Escolha a opção de redimensionamento 1/2 com uma opção de qualidade de sem interpolação (rápida).
- Ajuste a barra de slides para 100 (mais alto) na guia compactação de imagem . iniciar a conversão.
Nota: a opção de redimensionamento é evitar abrandar a velocidade do computador quando 3D processado; no entanto, ele pode resultar em uma resolução mais baixa quando redimensionado extensivamente. Sugerimos redimensionar ao meio para resolução aceitável com melhor manuseio.
6. reconstrução 3D
- Execute o software de renderização de volume 3D.
- Selecione ações > carregar dados de volume para iniciar o DataSet.
- Ajuste o brilho e o nível de contraste modificando a função de transferência de forma no histograma na guia Editor de função de transferência .
- Selecione opções > Lighting.
- Selecione sombras e ícones de iluminação de superfície . Estes efeitos proporcionam um tom de modelagem realista.
- Encontre a melhor visualização movendo-se (clique e arraste), girando (clique com o botão direito do mouse e arraste), e ampliando ou saindo do (rolar) o modelo.
- Deslize o plano (Shift + clique e arraste na direção interna) para mostrar as imagens seccionais (Figura 3).
- Ative o ícone de luz . Ajuste a barra de indicação de iluminação e encontre a melhor iluminação para visualização. Em seguida, desligue o ícone e feche a guia iluminação .
- Selecione opções > Mostrar > caixa de recorte para ocultar a caixa para a imagem final.
- Selecione ações > Salvar imagem para armazenar a imagem.
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Representative Results
A reconstrução detalhada do ORL foi alcançada pela Microtc com a preparação da PTA (Figura 4). A estrutura fibromuscular ligamentar que se estende obliquamente entre a derme e o periósteo foi distintamente observada (figura 4a). Na visão coronal (Figura 4B), a quantidade e a complexidade das fibras aumentaram lateralmente. Na visão horizontal (Figura 4C), observou-se um trabalho de malha elaborado com formação arborizada. Observou-se uma forma caracterizada por placas contínuas, ao invés de fibras rosadas, como relatado anteriormente. Na visão sagital (Figura 4D), as espessuras das fibras ORL diminuíram inferiormente. Globalmente, esta observação multidirecional provou que o ORL é composto de uma malha multicamada de placas contínuas com variação no número e espessura dependendo da localização.
Figura 1. As amostras foram colhidas e coradas com solução de PTA.
(A). as amostras foram fixadas em formalina A 10% após a colheita. (B). as amostras foram cortadas em pedaços mais finos para aumentar a penetração e, em seguida, colocadas na solução PTA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O scanner microCT.
A seta indica a bandeja onde a amostra é colocada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. reconstrução 3D.
Deslize o plano para dentro da direção interna para ver as imagens seccionais no interior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. imagens 3D do ORL.
(A). a imagem global do ORL. (B). vista coronal. (C). vista horizontal. (D). vista sagital. S, superior; A, anterior; L, lateral; P, posterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Estruturas analisadas da ORL.
Amarelo, vermelho e verde indicam a pele, o músculo e o ligamento, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1. Comparação entre imagens 3D e 2D. (A). volume rendeu A imagem 3D. (B). imagem 2D seccional transversal. Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para baixar a figura.
Complementar Figura 2. Acondicionamento e fixação do parafilm. (A). envolvendo o parafilm sobre a amostra inteira para impedir secar para fora. (B). parafilm ajuda a fixar a amostra firmemente no scanner. (C). parafilm não é visível na digitalização microct e pode ser subtraída facilmente. Por favor clique aqui para baixar a figura.
Complementar Figura 3. Coloração insuficiente da PTA. Um espaço oco no centro mostra onde a solução PTA não penetrou suficientemente. (A). volume rendeu A imagem 3D. (B). imagem 2D seccional transversal. Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para baixar a figura.
Complementar Figura 4. Comparação entre cadáveres frescos e embalsamados. Não foram encontradas diferenças entre cadáveres frescos e embalsamados para aplicação do protocolo. A imagem mostra outro recurso pode ser tomado pelo mesmo método também. (A). o ORL obtido de um cadáver fresco. (B). o vinco nasolabial obtido de um cadáver embalsamado. Por favor clique aqui para baixar a figura.
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Discussion
Nós implementamos o microCT com preparação do PTA no exame de tecidos macios humanos. Resumidamente, os espécimes são colhidos e fixados em formalina por alguns dias, seguidos de desidratação em soluções de etanol serial. Coloc a amostra na solução do PTA diretamente depois que a fixação do formalina pode conduzir a algum rachamento do tecido devido à desidratação rápida. Conseqüentemente, a desidratação de série é necessária antes da mancha de PTA. Em seguida, as amostras são manchadas usando a solução PTA por cerca de uma semana. A varredura de MicroCT, a reconstrução 3D, e a análise podem então ser executadas. Nosso objetivo era observar o ORL e estruturas adjacentes usando este método. Apresentamos com sucesso o tecido como um modelo 3D. A pele, os ligamentos e os músculos foram visualizados distintamente (Figura 5).
Vários pontos devem ser considerados durante o processamento das amostras. O tamanho de uma amostra e a duração da coloração são preocupações principais. Após vários estudos-piloto, verificou-se que a espessura adequada de um espécime é de cerca de 5 – 7 mm e a duração adequada da coloração é de 5 a 7 dias. Nestas condições, a solução PTA penetra o espécime a uma taxa de aproximadamente 1 mm/dia. Se a espessura exceder 7 mm, o tempo de processamento aumenta. Quando a duração da coloração é insuficiente em comparação com o volume de uma amostra, a imagem final pode incluir um furo vazio na área central da amostra. Isso geralmente ocorre, especialmente no nível da pele, e removendo a pele desnecessária pode melhorar a eficiência de coloração. Quando a duração é muito longa, toda a amostra será supermanchada, dificultando a identificação de cada compartimento. Um estudo mais adicional na duração óptima para manchar espécimes maiores poderia provar útil.
Geralmente, o espécime é dividido em partes para realçar a penetração; é importante recordar a posição e a direção de cada espécime durante este processo. Para manter essas informações, é recomendável costurar na mesma região de cada peça. O fio será visto na imagem final, e um deve ter cuidado para que o segmento não interfere com a área principal. Por exemplo, a costura na região superolateral de cada peça pode ser útil. Adicionalmente, análises preliminares de uma estrutura anatômica são necessárias para reconhecer cada parte do tecido devido à sua complexidade.
Parafilm e outros materiais são usados para impedir espécimes da secagem para fora. No entanto, ligeiras deformidades podem ocorrer ao envolver espécimes. É importante preservar a forma original na maior medida possível. Às vezes, um tubo líquido é usado, em vez de parafilm. No entanto, mesmo o menor tremor de uma máquina tem o potencial de afetar o tubo durante a digitalização e pode reduzir a clareza da imagem final.
Existem várias limitações a esta abordagem. Primeiro, este protocolo não pode ser feito com um objeto vivo. Além disso, o tamanho da amostra é restrito pelo tamanho máximo de digitalização do scanner microCT. Pode haver erros ao analisar a imagem renderizada a olho nu; Conseqüentemente, os experimentos histológicos adicionais podem ser necessários para confirmar os resultados. Pode haver uma ligeira distorção dimensional durante a preparação; no entanto, acreditamos que isso não afeta significativamente o resultado do estudo.
A varredura de MicroCT com preparação do PTA é vantajosa para examinar compartimentos específicos dentro de uma estrutura complexa. Este estudo centrou-se no desenvolvimento de um método para melhorar a taxa de contraste usando a preparação da PTA, e outras características, como processos de digitalização e reconstrução, foram indicadas brevemente. No entanto, os leitores devem ser capazes de obter o mesmo resultado se usarem scanners microCT contemporâneos e programas de análise de imagem após o processo de coloração. Este método pode ser útil nas análises de tecidos e estruturas oncológicos, na contribuição nervosa em áreas específicas e em estruturas anatômicas de alta resolução de órgãos, como o coração e o fígado13,14,15.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por um subsídio de pesquisa do corpo docente da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei (6-2018-0099). Os autores agradecem às pessoas que doaram muito generosamente seus corpos para a faculdade de medicina da Universidade de Yonsei. Estamos gratos a Jun Ho Kim e Jong Ho Bang por seu apoio técnico (membros da equipe do centro de educação em anatomia cirúrgica da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei). Nós somos gratos igualmente a Genoss co., Ltd. para o sistema de varredura de alta qualidade de microCT usado nesta pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
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