Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Coincubation Асссе для количественной оценки конкурентных взаимодействий между Vibrio fischeri Изоляты

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/59759
Automatic Translation
1, 1
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

Бактерии кодируют различные механизмы для участия в межбактериальной конкуренции. Здесь мы представляем культурный протокол для характеристики конкурентных взаимодействий между бактериальными изолятами и того, как они влияют на пространственную структуру смешанной популяции.

Abstract

Данная рукопись описывает культурный, монетный опрос для обнаружения и характеристики конкурентных взаимодействий между двумя бактериальными популяциями. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые позволяют каждой популяции быть дифференимно помечены с различными возможностями устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки для отбора и визуальной дискриминации каждой популяции, соответственно. Здесь мы описываем подготовку и coincubation конкурирующих штаммов Vibrio fischeri, флуоресцентную микроскопию изображений и количественный анализ данных. Этот подход прост, дает быстрые результаты, и может быть использован для определения того, одна популяция убивает или подавляет рост другой популяции, и является ли конкуренция опосредована через диффузионную молекулу или требует прямого контакта клеток. Поскольку каждая бактериальная популяция выражает различные флуоресцентные белки, анализ позволяет пространственной дискриминации конкурирующих групп населения в смешанной колонии. Хотя описанные методы выполняются с помощью симбиотической бактерии V. fischeri с использованием условий, оптимизированных для этого вида, протокол может быть адаптирован для большинства виновных бактериальных изолятов.

Introduction

В этой рукописи излагается культурный метод определения того, способны ли два бактериальных изолята к конкурентным взаимодействиям. При изучении смешанных популяций важно оценить, в какой степени бактериальные изоляты взаимодействуют, особенно в том, что изоляты непосредственно конкурируют с помощью механизмов помех. Интерференция конкуренции относится к взаимодействиям, где одна популяция непосредственно препятствует росту или убивает конкурента населения1. Эти взаимодействия имеют важное значение для выявления, поскольку они могут иметь глубокое воздействие на структуру микробного сообщества и функции2,3.

Механизмы микробной конкуренции были широко обнаружены в геномах бактерий из различных сред, включая как хос-ассоциированных и свободно живущих бактерий4,5,6,7, 8,9. Различные стратегии конкуренции были описаны10,11 в том числе диффузивные механизмы, такие как бактерицидные химические вещества1,12 и секретированные антимикробные пептиды13 , а также контактно-зависимые механизмы, которые требуют контакта клетокдля передачи ингибирующего эффектора в клетки-мишени 9,14,15,16,17 ,18.

Хотя культурные монеты обычно используются вмикробиологии 5,8,19, эта рукопись описывает, как использовать анализ для характеристики механизма конкуренции, а также предложения по адаптации протокол для использования с другими бактериальными видами. Кроме того, этот метод описывает несколько подходов к анализу и представлению данных для ответа на различные вопросы о характере конкурентных взаимодействий. Хотя методы, описанные здесь были использованы ранее для выявления межбактериального механизма убийства, лежащего в основе внутриспецифической конкуренции между симбиотических штаммов coisolated Vibrio fischeri бактерий19, они подходят для многие бактериальные виды, включая экологические изоляты и патогены человека, и могут быть использованы для оценки как контакт-зависимых, так и диффузионных конкурентных механизмов. Шаги в протоколе могут потребовать оптимизации для других видов бактерий. Учитывая, что все больше модельных систем расширяют свои исследования за пределы использования изогенных организмов, чтобы включить различные генотипы10,16,20,21, этот метод будет ценным ресурсом для исследователей, стремящихся понять, как конкуренция влияет на многослойные или многовидовые системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка штаммов для Coincubation

  1. Выберите соответствующий эталонный штамм, который будет служить мишенью для бактериальной конкуренции во время проверки coincubation. Ознакомьтесь с рекомендациями при выборе эталонного штамма и как эталонный штамм повлияет на результаты. В этом протоколе штамм V. fischeri ES114 будет служить эталонным штаммом.
  2. Определение методов отбора и скрининга будет использоваться для разграничения изолятов в монетокубации
    1. Как правило, для выбора для каждого штамма трансформируются штаммы со стабильными плазмидами, содержащими различные гены устойчивости к антибиотикам (например, канамицин или хлорамфеникол), а также гены, кодирующие различные флуоресцентные белки (например, GFP или RFP) различать типы штаммов в кокультуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стабильных плазмидов необходимо, потому что если штамм теряет плазмид в отсутствие отбора, то номера этого штамма будут занижены при количественном количественном, и не будет визуально обнаруженс с помощью флуоресценционной микроскопии.
    2. Тег coincubated V. fischeri штаммов диффереченно так, что один штамм содержит плазмид pVSV102, который выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) и устойчивость к антибиотику канамицин (KanR), и второй штамм содержит плазмид pVSV208, который выражает красный флуоресцентный белок (dsRed) и устойчивость к антибиотику хлорамфеникол (CmR)22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие различные выборы могут быть использованы для различения coincubating штаммов. Смотрите Обсуждение дополнительных методов.
    3. Включите следующий контроль во время первоначальной оптимизации проверки coincubation, чтобы убедиться, что выбор является надежным. Плита каждого штамма, который диффереденциально помечены на агар пластин, содержащих антибиотик, который должен выбрать против него (т.е., пластины штамм 1 на носителях, что выбирает для штамма 2, и наоборот).
  3. За два дня до coincubation асссе, полоса ссылка штамм pVSV102, эталонный штамм pVSV208, и каждый конкурент штамм pVSV208 от -80 КС запасов на LBS агар пластин, содержащих соответствующие антибиотики (например, 100 мкг /мл канамицин или 2 мкг /мл хлорамфеникол) и инкубировать на ночь при 24 градусах Цельсия. Выбор антибиотиков необходим для обеспечения того, чтобы все клетки содержали плазмид в начале эксперимента.
  4. За день до проведения асссе, выбрать и restreak четыре отдельных колоний на штамм типа (биологические репликации) на свежие пластины агар LBS с соответствующими антибиотиками и инкубируется на ночь при 24 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребовать оптимизации для других видов бактерий, так как для получения достаточного количества клеток может потребоваться более длительное или короткое время инкубации в зависимости от темпов роста интересующего организма организма.

2. Кубибет Бактериальные штаммы

  1. Подготовка каждого бактериального штамма для инкубации(рисунок 1A)
    1. Используя стерильную зубочистку, соскребите клетки из агаровой пластины (размером с рисовое зерно) и повторно приостановите клетки в микроцентрифуговой трубке объемом 1,5 мл, содержащей 1 мл бульона LBS. Разбейте ячейки сгустки, нажав их в сторону трубки и пипетки вверх и вниз энергично.
    2. Крышка трубки и вихря для 1-2 с. Если ячейки сгустки все еще видны, продолжайте вихрь или пипетка вверх и вниз, пока образец визуально однородный.
    3. Повторите шаги 2.1.1-2.1.2 для всех образцов.
  2. Измерьте и запишите оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600) для всех образцов. Образцы, вероятно, должны быть разбавлены до десяти раз с помощью бульона LBS для получения точного измерения OD. Нормализовать каждый образец до желаемого OD600. Штаммы, как правило, нормализованы до OD600 й1.0, что переводится как 106 бактерий / мл для V. fischeri.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребовать оптимизации для различных видов бактерий, так как плотность клеток инокулума влияет на результаты coincubation в зависимости от механизма конкуренции. Смотрите обсуждение для оптимизации.
  3. Кукуинпромтинг штаммов(рисунок 1B, C)
    1. Смешайте эталонный штамм и напряжение конкурентов в соотношении 1:1 (v/v), добавив 100 мл каждого штамма (нормализованного до OD 1.0) к помеченной 1,5 мл центрифуги трубки. В качестве элемента управления смешайте эталонный штамм с дифференциально помеченной версией самого себя (справочный штамм pVSV102 - эталонный штамм pVSV208). Этот контроль необходим для последующего статистического анализа, чтобы определить, влияет ли наличие штамма конкурентов на рост эталонного штамма. Вихрь смешанной деформации культуры для 1-2 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребовать оптимизации, поскольку стартовое соотношение может существенно повлиять на результаты и, возможно, потребуется скорректировать. Смотрите обсуждение для оптимизации.
    2. Повторите шаг 2.3.1 для каждой биологической репликации. После завершения этого шага, должно быть в общей сложности восемь смешанных штаммов трубки: четыре биологических репликации с дифференциально-тегами эталонных штаммов (контроль), и четыре биологических репликации с дифференимно помечены ссылки и конкурент штаммов ( экспериментальных).
    3. Пятно 10 мл каждой контрольной и экспериментальной смеси на пластины Петри, содержащие агар LBS; эти культурные пятна будут использоваться для флуоресценции микроскопии после инкубации.
    4. Разрешить пятна полностью высохнуть на скамейке, пока вся жидкость была поглощена в агар и инкубировать Петри пластин при 24 градусах по 24 ч. Минимум 15 ч требуется для Штаммов V. fischeri, помеченных pVSV102 и pVSV208, чтобы вырасти до достаточно высокой плотности клеток, чтобы визуализировать GFP и RFP, соответственно, на уровне населения с помощью флуоресцентного рассекающего микроскопа. Здесь мы используем 24 ч инкубации для визуализации смешанных пятен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать пластины, которые не слишком влажные или слишком сухие. Если пластины слишком влажные, пятна для монетней не будут впитываться в агаровую пластину; избегать использования пластин наливают в тот же день. Если пластины слишком сухие, небольшие волны или трещины могут образовываться на поверхности агара, делая пятна монеты нерегулярной формы.
    5. Используя те же бактериальные суспензии, что и в шаге 2.3.3, разместите 10 мл каждой контрольной и экспериментальной смеси в 24-колодские пластины, содержащие 1 мл агара LBS на скважину. Как и в шаге 2.3.3, обеспечить агар в 24-колодцепластинах имеет соответствующую влагу. Разрешить пятна, чтобы высохнуть полностью и инкубировать при 24 градусах по Цельсию в течение 5 ч. Эти культурные пятна будут использоваться для количественной оценки подразделений, формирующих колонии (CfUs) для каждого штамма в конце эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение бактериальных суспензий для роста в отдельных скважинах позволяет легче повторного вконечном времени. Этот шаг может быть выполнен с помощью квадратных стерильных частей фильтра в качестве более экономичный подход к использованию 24-коловидной пластины. Квадратные стерильные кусочки фильтра могут быть размещены на агарпластинке, и 10 мл каждой экспериментальной смеси могут быть замечены на этих фильтрах, а не на 24-колодцах. После чеканки фильтры могут быть перенесены в 1,5 мл центрифуги трубки и coincubation пятно может быть resuspended путем вихря или пипетки вверх и вниз. 5 ч инкубационного времени достаточно для обнаружения межбактериальных убийств между V. fischeri изолирует19, однако, это время coincubation, возможно, потребуется короче или дольше для других видов или конкурентных механизмов. Более подробную информацию можно узнать из обсуждения.
  4. Серийное разбавление для начала инокулума
    1. Для выполнения серийного разбавления стартовых монетокубационных смесей, поверните 96-колодцовную пластину 90 ", так что есть восемь колонн и двенадцать рядов. Каждая строка будет содержать образец неразбавленной смеси в первой колонке, а затем семь десятикратных серийных разбавлений через оставшиеся скважины в строке(рисунок 2A).
    2. Наметьте каждую строку идентификатором деформации, номером репликации и временем (начиная инокулум и T0). Этикетка LBS агар пластины дополнены соответствующим антибиотиком, на котором обнаружить разбавления серии. Не забудьте определить, какой штамм каждая пластина антибиотиков выбирает для.
    3. Используя многоканальную пипетку, добавьте 180 мл бульона LBS к каждой скважине, оставляя первую колонку пустой для неразбавленной смеси coincubation.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут выбрать для использования фосфата буферного солевой раствор (PBS) для повторного coincubation пятна и выполнять серийное разбавление при работе с особенно быстро растущих бактериальных видов или последовательно выполняя крупные эксперименты, где серийные разбавления могут занять долгое время, чтобы выполнить. Использование PBS в этих случаях предотвратит значительный рост бактерий в процессе выполнения серийных разбавлений. Однако важно соответствовать тому, какое решение используется (например, PBS или LBS) во всех экспериментах, независимо от их размера или продолжительности.
    4. Используя 200 мл одноканального пипетки, перенесите 100 мл смеси монеты из трубки в первую колонку. Отбросьте кончик и повторите для всех монетокубационных смесей.
    5. Используя многоканальный пипетки, перенесите 20 мл от столбца 1 на 2 и смешайте, прокладывая вверх и вниз. Откажитесь от кончиков и повторите для каждого столбца так, чтобы к концу каждого ряда было десятикратное серийное разбавление первоначальной смеси coincubation.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте в соответствии с количеством раз раз разбавления трубчатые вверх и вниз. Например, угнение ручки пипетки пять раз для каждого разбавления, чтобы быть последовательным по всей серии разбавления.
    6. Используя многоканальный пипетка, оснащенный восемью наконечниками, аспир 5 мл от каждой скважины в серии разбавления (т.е. один ряд из восьми скважин) и наместите его на агарную пластину LBS, которая выбирает для эталонного штамма (дополненный канамицином). Повторите этот шаг пятнистость на пластине выбора для конкурента штамма (дополнены хлорамфеникол)(рисунок 2B). Разрешить пятна полностью высохнуть до размещения в инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Те же советы могут быть использованы для обнаружения репликации разбавления серии на пластинах выбора для ссылки и конкурента штамма, но должны быть изменены между репликациями. Избегайте прикосновения к концу пипетки наконечник агар пластины, как это может создать депрессию, которая может напоминать бактериальной колонии и перекос результаты во время пластины рассчитывает. Если наконечник действительно касается пластины, сделать заметку и не включать депрессию в колонии рассчитывает.
  5. Проведение окончательных измерений T
    1. После coincubation пятна в 24-колодце пластин были инкубированы в течение 5 ч при 24 градусах Цельсия, добавить 1 мл бульона LBS к каждой скважине и resuspend монеты пятна пайпеттинг вверх и вниз, пока все клетки повторно. Будьте в соответствии с силой, в которой клетки переприкиваются во всех репликациях. Например, угнетайте ручку пипетки восемь раз, чтобы полностью восстановить каждый образец.
    2. После того, как каждое место coincubation resuspended, подготовить 96-ну хорошо пластины для серийного разбавления и LBS агар пластины с соответствующими антибиотиками, на которых обнаружить разбавления таким же образом, как шаг 2.4.1.
    3. Выполните шаги 2.4.2-2.4.6 для завершения серийного разбавления для окончательных измерений T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важный контроль должен быть включен в ходе первоначальной оптимизации проверки coincubation. В конце периода coincubation, пластины смешанных штаммов на средства массовой информации, которая включает в себя оба антибиотика. Ни один из штаммов не должен расти, если 1) спонтанная мутация происходит, или 2) выбираемые маркеры обмениваются между штаммами.

3. Визуализация Coincubations использованием флуоресценции микроскопии

  1. Изображение каждого пятна coincubation на пластинах lbS agar Petri со ступеней 2.3.3 и 2.3.4 с помощью стерео микроскопа, оборудованного для обнаружения зеленой и красной флуоресценции, которые соответствуют белкам флуоресценции, выраженным на стабильных плазмидах.
  2. Начните с изображения контрольного пятна монеты (ссылка штамм pVSV102 - эталонный штамм pVSV208).
    1. Отрегулируйте увеличение так, чтобы пятно находится в фокусе.
    2. Используя соответствующий свет возбуждения и фильтр для наблюдения GFP, отрегулируйте время экспозиции, чтобы обнаружить только флуоресценцию от пятна coincubation и любой фоновой флуоресценции от средств массовой информации является низким или не видимым.
    3. Измените свет возбуждения и фильтр для наблюдения RFP, регулируя время экспозиции, чтобы свести к минимуму фон от среды.
  3. Для каждого пятна coincubation от экспериментальных методов лечения, изображение для эталонного штамма с помощью фильтра GFP и время экспозиции определяется в шаге 3.2.2.
  4. Изображение штамма конкурента с помощью фильтра RFP, регулируя время экспозиции так, что флуоресценция наблюдается только от пятна coincubation и фоновая флуоресценция от среды минимальна. Сохранить оба изображения и назвать их, чтобы включить оба идентизации штамма, номер репликации, время инкубации, когда изображение было принято (например, 24 ч). Повторите для всех репликатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время coincubation может быть отрегулировано для по-разному плазмидов или бактериальных видов. Смотрите обсуждение для оптимизации.

4. Анализ данных

  1. Расчет CfUS для каждого контрольного и экспериментального лечения в каждый временной момент (T старт и T final)
    1. После того, как колонии видны на серийных разбавления пластин (например, 24 ч при 24 градусах По Цельсия для V. fischeri),определить фактор разбавления, где отдельные колонии могут быть подсчитаны и не выросли вместе в большие, многоколониальные кластеры(рисунок 2B). Для каждого репликации, подсчитайте и запишите количество отдельных колоний для данного разбавления. Это число представляет cfUs для этой репликации.
    2. Преобразуйте CfUs для разбавления в общую сумму CFUs для каждого штамма в coincubation с помощью формулы ниже:
      - CFUS (фактор разбавления x vol. места разбавления) х vol. неразбавленного образца - общий CFUs
      Пример: T0: (6 CFUs)
      T5: (4 CFUs) ( (10 х-3 х 0,005 мл) х 1,0 мл-
      Значения CFU для каждого штамма в каждой точке времени являются необработанными данными, которые могут быть использованы для нескольких различных анализов и статистических тестов (см. раздел 4.2 ниже).
  2. Выполните следующие преобразования данных, чтобы определить, является ли штамм конкурента outcompetes эталонного штамма: (i) определение того, уменьшается доля эталонного штамма в присутствии штамма конкурента, или (ii) расчет относительного конкурентного индекса (RCI). Эти анализы преобразуют исходные данные в соотношения и могут быть полезны для определения конкурентного результата взаимодействия, но не могут определить механизм конкуренции (т.е. убийство против ингибирования роста).
    1. Расчет доли каждого штамма для каждого момента во время чеканки
      1. Преобразуйте данные CFU в долю каждого штамма в лечении. Для эталонного штамма (RS) на T0 разделите общий CFUs для эталонного штамма на T0 на сумму общего CFUs для эталонного штамма и конкурента (CS) на T0:
        RST0 CFUs (RST0 CFUs - CST0 CFUs) - Пропорция эталонного штамма на T0.
        Выполните тот же расчет, чтобы определить долю штамма конкурента на T0:
        CST0 CFUs (RST0 CFUs - CST0 CFUs) - Пропорция эталонного штамма при T0
        Повторите этот процесс для каждого момента и реплицировать для экспериментального лечения и контроля лечения (дифференциально помечены ссылка штамм coincubation).
      2. График средняя доля каждого типа штамма на T0 и T5 в сложенный график бар(рисунок 3A).
      3. Обеспечить получение желаемого стартового соотношения штаммов. Для coincubations, где штаммы были первоначально смешаны 1:1, каждый тип штамма должен составлять 0,5 от населения на T0 и не должны статистически отличаться друг от друга с помощью T-тест студента (P Если доля одного штамма значительно больше, чем у другого штамма на T0, то повторяйте эксперимент до достижения стартового коэффициента 1:1.
      4. Определите, состоит ли штамм конкурента значительно большую долю населения после 5 ч. Выполните t-тест студента, сравнивая долю каждого штамма в экспериментальном лечении на T0 и T5. Если доля штамма конкурентов значительно отличается от эталонного штамма на T5 (P qlt; 0.05), этот результат предполагает, что конкуренция штамма, возможно, имели место. Переход к шагу 4.2.1.5.
      5. Чтобы определить, уменьшило ли наличие штамма конкурента пропорцию эталонного штамма после 5 ч, выполните T-тест студента, сравнивая пропорцию эталонного штамма в контроле с долей эталонного штамма в экспериментальное лечение (справочный штамм против напряжения конкурента).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если доля эталонного штамма статистически ниже в экспериментальном лечении по отношению к контролю (P qlt; 0.05), то напряжение конкурента значительно уменьшило пропорцию эталонного штамма после 5 ч и вне себя эталонного штамма.
    2. Расчет значения RCI журнала для каждого лечения (включая контроль)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Относительный конкурентный индекс, или RCI, представляет собой единое значение, которое сравнивает, как конечное соотношение типов деформации отличается от исходного коэффициента. Значение RCI преобразуется таким образом, что значение rcI журнала больше нуля указывает на напряжение конкурента (CS), превысив референтное значение (RS), значение журнала RCI менее нуля указывает на то, что эталонный штамм превысился напряжение конкурентов, а журнал RCI значение нуля указывает на то, что ни один из штаммов не был перебором.
      1. Рассчитайте значения RCI журнала для каждого управления и экспериментального лечения с помощью следующего уравнения:
        Войти в журнал (CST5 CFU и RS T5 CFUs)
      2. Значение журнала RCI с помощью разделенной коробки и усов, где данные отображаются в горизонтальном направлении(рисунок 3B).
      3. Определите, значительно ли отличается каждая обработка от нуля, выполняя t-тест студента, сравнивая значения RCI журнала каждого лечения (включая элемент управления) с набором данных, сравнивая одинаковое количество репликаций с нулевым значением. Если значения журнала RCI для экспериментального лечения статистически больше нуля (P qlt; 0.05), то штамм конкурента превалировал эталонный штамм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль не должен статистически отличаться от нуля (P 0.05), потому что дифференциально помеченные эталонные штаммы являются изогенными.
      4. Выполните T-тест студента, чтобы определить, были ли значения RCI журнала для экспериментального лечения значительно больше, чем контроль (P qlt; 0.05). Если значения RCI журнала от экспериментального лечения статистически больше, чем контрольная обработка, то штамм конкурента переоценил эталонный штамм.
  3. Выполните следующий статистический анализ, чтобы определить механизм, с помощью которого штамм конкурента превосходит эталонный штамм: (i) анализ необработанных общих данных CFU, или (ii) изучить процентное восстановление эталонного штамма. Эти анализы могут быть более громоздкими для просмотра по отношению к тем, от шага 4.2, но будет определить, является ли конкурент штамм outcompetes эталонный штамм, перерастая его, препятствуя росту эталонного штамма, или активно устраняя эталонный штамм.
    1. Анализ необработанных общих данных CFU
      1. График сырья общие данные CFU для обоих штаммов с помощью переплетенного рассеяния участок, где репликации показаны в виде отдельных точек данных (Рисунок 4A). Отображение данных в масштабе журнала и добавление горизонтальной линии, указывающей на средние CФУ T0 для обоих штаммов.
      2. Чтобы определить, влияет ли наличие штамма конкурента негативно ещивающее референтное напряжение, выполните t-тест студента, сравнивая референтный штамм CFUs для контроля и экспериментального лечения на T5. Если эталонный штамм CFUs в экспериментальном лечении статистически ниже, чем в контрольном (Pqlt; 0.05), то наличие штамма конкурента значительно повлияло на эталонный штамм.
      3. Чтобы определить, является ли наличие штамма конкурента либо ингибирует рост или устранены ссылка штамма, выполнить T-тест студента сравнения эталонного штамма CFUs на T0 и T5 для контроля и экспериментального лечения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В отсутствие конкурента, эталонный штамм должен показать значительное увеличение CFU при сравнении T0 и T5 для контрольного лечения. При анализе экспериментального лечения, если эталонный штамм CFUs на T5 статистически не отличаются по сравнению с T0 (P 0,05), то штамм конкурента тормозил рост эталонного штамма. Если эталонный штамм T5 CFUs значительно ниже, чем T0 CFUs (Pqlt; 0.05), то штамм конкурента убил эталонный штамм.
    2. Расчет процентного восстановления эталонного штамма
      1. Преобразование общих данных CFU для эталонного штамма (RS) в данные о процентном восстановлении с помощью ниже приведенного уравнения:
      2. (RST5 CFUs - RST0 CFUs) x 100 - % восстановление эталонного штамма
      3. Отображение процентного восстановления эталонного штамма с помощью разделенного графика бара, где каждый бар представляет либо контроль или экспериментальное лечение(рисунок 4B). Добавьте пунктирную линию на уровне y 100, чтобы указать 100% восстановление эталонного штамма (без увеличения или уменьшения референтного штамма CFUs с 0 ч до 5 ч).
      4. Чтобы определить, является ли напряжение конкурента негативно повлияло на эталонный штамм, выполните T-тест студента, сравнивая восстановление эталонного штамма для контрольного лечения с экспериментальным лечением. Если процентное восстановление значительно меньше, чем контроль (Pqlt; 0.05), то напряжение конкурента негативно повлияло на эталонный штамм.
      5. Чтобы определить, является ли штамм конкурента тормозил рост или устранить эталонный штамм, выполнить T-тест студента сравнения эталонного штамма процент восстановления для экспериментального лечения и набор данных с тем же количеством репликаций все с значение 100.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспериментальное лечение статистически не отличается от 100 (P 0.05), то штамм конкурента тормозил рост эталонного штамма. Если эталонный штамм процент восстановления в экспериментальном лечении значительно ниже, чем 100 (P lt; 0,05), то конкурент штамм убил эталонный штамм.
    3. Интерпретация флуоресцентных микроскопических изображений
      1. После того, как флуоресцентные микроскопии изображения принимаются, определить, является ли каждый штамм заметно обнаружить в месте coincubation. Для контрольной монеты (справочный штамм pVSV102 - эталонный штамм pVSV208) как GFP, так и RFP должны быть видны с одного места монетопоиска. Если это не так, назначьте эксперимент снова обеспечения штаммов должным образом помечены и придуманы на безантибиотиков пластин.
      2. Для каждого экспериментального пятна coincubation, проверьте возможные результаты.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если штамм конкурента виден, но эталонный штамм не обнаружен, это говорит о том, что штамм конкурента погибает или тормозит рост эталонного штамма. Если оба штамма присутствуют и равномерно смешаны (GFP и RFP присутствуют на протяжении всего пятна coincubation), эти данные свидетельствуют о том, что штамм конкурента не конкурирует с эталонным напряжением, и оба штамма сосуществуют. Если оба штамма присутствуют, но пространственно разделены (микроколонии либо GFP или RFP присутствуют по всему пятну coincubation), что предполагает, что эталонный штамм и напряжение конкурентов могут участвовать в конкурентных взаимодействиях и модификациях может потребоваться эталонный штамм или начальное соотношение монеток. Более подробную информацию можно узнать из обсуждения.

5. Определение того, зависит ли взаимодействие от контактов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы обнаружите, что один штамм убивает или подавляет эталонный штамм, взаимодействие может быть диффузионным или контактным. Чтобы определить, зависит ли взаимодействие от контакта клеток, выполните проверку чеканки, как описано выше, для шагов 1-2 со следующими изменениями.

  1. Выполните шаги 1.1-2.2.
  2. После нормализации штаммов физически отдельные штаммы с помощью фильтра нитроцеллюлозы с размером пор0,22 мм. Этот размер пор позволяет диффузии противомикробных препаратов и малых молекул, но предотвращает физический контакт между клетками V. fischeri.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если взаимодействие зависит от контакта клеток, разделение эталонного штамма от штамма конкурента с фильтром должно аннулировать убийство или ингибиторфесвоего фенотипа и эталонный штамм не должен был уменьшить CFUS. Если взаимодействие не зависит от контакта клеток, и является диффузионным механизмом, разделение штаммов не должно препятствовать штамму конкурента убить эталонный штамм.
    1. Найдите 5 мл эталонной деформации на центр фильтра и напрягите 5 мл напряжения конкурента на центр другого фильтра. Поместите фильтр, содержащий эталонную деформацию, на поверхность агарной пластины LBS. Поместите фильтр, содержащий напряжение конкурента непосредственно на верхней части фильтра с эталонным напряжением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый штамм пятнистый на фильтры, а не нижней деформации пятнистый непосредственно на агар пластины так штаммы могут быть более легко размещены непосредственно друг на друга.
    2. Если есть опасения, что штаммы не укладываются непосредственно друг на друга, уменьшить объем эталонного штамма inoculum пятнистый на фильтр. Это обеспечит площадь эталонного места штамма меньше и полностью выше или ниже напряжения конкурента. Альтернативные, какие штаммы сверху и на дне, чтобы объяснить различия в диффузии питательных веществ из агар среды.
    3. Для обеспечения фильтр ампипулы позволяет диффузии малых молекул, включают контрольную обработку, где эталонный штамм пятнистый на фильтр и антибиотик, что он чувствителен к (хлорамфеникол) пятнистый на другой. Стек фильтры непосредственно друг на друга и место на пластине агар LBS. Антибиотик должен быть в состоянии распространяться через фильтр и должен убить эталонный штамм.
  3. Инкубировать пластины с фильтрами при 24 градусах по 5 ч. Не инвертировать агар пластины при инкубации, чтобы избежать перемещения фильтров.
  4. Выполните серийные разбавления для стартового инокулума в соответствии с шагом 2.4.
  5. Проведение окончательных измерений T
    1. Используя стерильные пинцеты, перенесите каждый набор фильтров в трубку Falcon мощностью 50 мл, содержащую 5 мл бульона LBS. Убедитесь, что фильтры физически разделены внутри трубки, чтобы обеспечить полную перезагрузку каждого типа штамма.
    2. Resuspend штаммов из фильтров путем pipetting вверх и вниз, пока фильтры не будут очищены от всех клеток. Используйте пинцет для поворота фильтров и прозрачного клеточного материала с обеих сторон. Стерилизовать пинцет с этанолом между образцами.
    3. Выполните серийное разбавление для T финала в соответствии с шагом 2.5. При расчете общего CFUs для T final отрегулируйте "общий объем неразбавленной выборки" с 1 мл до 5 мл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для оценки конкурентного взаимодействия между бактериальными популяциями был разработан и оптимизирован протокол проверки монеток для V. fischeri. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые кодируют гены устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки, что позволяет дифференциальный отбор и визуальную дискриминацию каждого штамма. Проанализировав данные, собранные в ходе анализа монет, можно определить конкурентный результат взаимодействия и механизм взаимодействия. Например, следующие эксперименты проводились с использованием изолятов V. fischeri. Coincubated штаммов укрывал один из двух стабильных плазмидов: pVSV102, выражающих сопротивление канамицинина и GFP, или pVSV208, выражающий сопротивление хлорамфениколи и DsRed. В выборочных данных штаммы смешивались в соотношении 1:1 и инкубировались на агарных пластинах LBS в течение 5 ч. В качестве контрольного лечения, дифференциально помеченные версии эталонного штамма были придуманы друг с другом. Экспериментальные процедуры были выполнены с эталонным штаммом (укрывательство pVSV102) и либо конкурент штамм 1 или конкурент штамм 2 (укрывательство pVSV208). Культуры каждого штамма были подготовлены и совмещены, как описано выше, и как показано на рисунке 1 и рисунке2.

На рисунке 3, данные проанализированы, чтобы определить, является ли конкурент штамм 1 или 2 outcompeted эталонный штамм представлен двумя способами. На рисунке 3Aдоля каждого типа штамма для каждого временного момента в ходе эксперимента была рассчитана в соответствии с шагом 4.2.1. В экспериментальных методах лечения, выборочные данные показывают, что эталонный штамм и штамм конкурента 1 присутствуют в пропорции 0,5 в начале (0 ч) и в конце (5 ч) эксперимента, что соответствует тому, что наблюдается в контрольной обработке. Эти данные показывают, что доля штаммов не изменилась после 5 ч coincubation, и поэтому никакой конкуренции не наблюдалось. В отличие от этого, когда эталонный штамм был инкубирован с штаммом конкурента 2, эталонный штамм присутствовал в пропорции 0,5 в начале (0 ч), и пропорции злит;0,01 в конце (5 ч) эксперимента, который был значительно ниже, чем контроль лечение (Студенческий t-тест: P злт; 0.001). Эти данные свидетельствуют о том, что доля эталонного штамма уменьшилась в присутствии штамма конкурента 2, и поэтому свидетельствуют о конкуренции между штаммом конкурента 2 и эталонным штаммом. Этот тип анализа должен применяться при определении того, как доля штаммов в сообществе изменяется с течением времени, но не может быть использован для определения механизма конкурентного взаимодействия, и поэтому должен сочетаться с дополнительным анализом. Например, доля эталонного штамма, уменьшающегося в присутствии штамма 2 конкурентов, может быть отнесена к нескольким типам взаимодействий: i) штамм 2 рос быстрее, чем эталонный штамм, (ii) штамм 2 тормозил рост эталона деформации, или (iii) штамм 2 устранены ссылка штамма путем убийства.

На рисунке 3B, журнал относительного конкурентного индекса (RCI) был рассчитан для каждого лечения в соответствии с шагом 4.2.2. Когда эталонный штамм был инкубирован с напряжением конкурента 1, значения RCI журнала статистически не отличались от нуля или от контрольной обработки (P qgt; 0.05), предполагая, что конкуренция между штаммами не наблюдалась. Однако, когда эталонный штамм был инкубирован с штаммом конкурента 2, значения журнала RCI были значительно больше нуля и контрольного лечения (Студенческий t-test: P qlt; 0.001). Эти данные свидетельствуют о том, что штамм 2 переборили эталонный штамм. Анализ значений RCI журнала предоставляет простой метод определения того, превзвали ли один штамм другой в инкубационный период. Поскольку этот анализ включает в себя соотношение штаммов в конце (5 ч) и начале (0 ч) эксперимента, исходное соотношение может существенно повлиять на результат. Поэтому исходное соотношение должно быть рассмотрено и учтено при выводе выводов из данных журнала RCI. Кроме того, этот анализ не дает информации о конкурентном механизме и просто сообщает о том, как меняется соотношение штаммов во время инкубации.

На рисунке 4 показаны два метода анализа данных для определения механизма конкуренции за данное взаимодействие. На рисунке 4Aотображается общее количество CФУ для каждого штамма в каждый момент эксперимента. Когда эталонный штамм был инкубирован с напряжением конкурента 1, CFUs обоих штаммов увеличиваются в течение 5 ч и CFUs для эталонного штамма не сильно отличались от штамма 1 или контроля на 5 ч (P Эти данные свидетельствуют о том, что эталонный штамм вырос в присутствии штамма 1, и свидетельствуют о том, что никакой конкуренции не наблюдалось. Однако, когда эталонный штамм был инкубирован с напряжением конкурента 2, штамм 2 CFUs увеличилось после 5 ч, но CFUs для эталонного штамма уменьшилась. Справочный штамм CFUs были значительно ниже, чем штамм 2 CFUs и контроль на 5 ч (Студенческий t-тест: P злт; 0,002). Эти данные показывают, что эталонный штамм CFUs уменьшается в присутствии штамма 2, и предполагают, что штамм 2 убивает клетки эталонного штамма. Если эталонный штамм не показал снижение CFUs, а не изменения (нет статистической разницы между эталонным штаммом CFUs на уровне 0 ч и 5 ч), эти данные предполагают, что штамм 2 превалит эталонный штамм, препятствуя росту эталонного штамма. Анализ непреобразованных общих данных CFU является особенно информативным, так как CFUs для обоих штаммов в каждый момент времени отображаются независимо и могут быть использованы для определения механизма конкуренции.

Рисунок 4B показывает процентное восстановление эталонного штамма, чтобы определить, как присутствие штамма конкурента влияет на эталонный штамм. Когда эталонный штамм был инкубирован с напряжением конкурента 1, было отмечено восстановление на 3200 процентов, что статистически не отличалось от контрольного и указывает на то, что штамм 1 не повлиял на процентное восстановление эталонного штамма. Когда эталонный штамм был инкубирован с напряжением конкурента 2, было отмечено восстановление на 4 процента, что было значительно ниже, чем контроль (Студенческий t-тест: P qlt; 0.002). Процент восстановления также значительно меньше, чем 100 (Студенческий t-тест: P qlt; 0,002), что свидетельствует штамм 2 outcompeted эталонный штамм, убивая ссылки штамма клеток. Если процентное восстановление статистически не отличалось от 100, эти данные предполагают, что штамм 2 тормозит рост эталонного штамма. Данные о процентном восстановлении обеспечивают упрощенный способ характеристики механизма конкуренции путем изучения того, как популяция эталонного штамма реагирует на наличие напряжения конкурентов. Однако отображение данных таким образом исключает информацию о стартовом соотношении, а также о том, как изменилось обилие штамма конкурентов на протяжении всей инкубации.

Figure 1
Рисунок 1: Flowchart иллюстрирующие coincubation асссе. (A) Бактериальные штаммы укрывательство либо pVSV102 (ссылка штамм указал Ref. Штамм или R.S.) или pVSV208 (конкурент штамм указал Comp. Штамм или C.S.) выращиваются отдельно на средствах массовой информации селективного для либо эталонный штамм (LBS Kan) или конкурент штамма (LBS Cam). Штаммы затем переприкиваются в бульоне LBS и нормализуются до OD 1.0. (B) Эталонный штамм и напряжение конкурента смешиваются в соотношении 1:1 по объему. Серийное разбавление выполняется с этой смесью, чтобы определить CFUs для обоих штаммов на 0 ч. (C) Штамм смесь затем пятнистый на 24-колодские пластины, содержащие агар LBS. Каждая реплика запятнана в свой собственный колодец. Пятна могут высохнуть, а затем инкубировать при 24 градусах по Цельсию в течение 5 ч. После 5 ч, серийное разбавление выполняется для количественной оценки CFUs для каждого штамма. (D) Смесь деформации из панели B также пятнистый на пластинах агара-агара LBS, разрешенных к высыханию и инкубации при 24 градусах по Цельсию в течение 24 ч. На 24 ч, монета кубации пятно изображен с помощью флуоресценции рассекающий микроскоп, который адаптирован для обнаружения зеленого (справочный штамм) и красный (конкурент штамм) флуоресценции. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные изображения пластин, необходимых для последовательного разбавления. (A) 96-колодец пластины используется для выполнения серийного разбавления. Пластина вращается таким образом, что есть 12 рядов и 8 колонн. Дескрипторы каждого лечения включают в себя используемые штаммы и плазмиды, которые они гавани (например, справочный штамм с pVSV102 и конкурент штамм с pVSV208) и репликации номер для каждого ряда (R1, R2, R3, или R4). Первый столбец представляет собой неразбавленный образец, а каждая колонка справа представляет собой 10-кратное разбавление от предыдущего столбца (коэффициент разбавления, перечисленный выше). (B) LBS агар пластины, используемые для определения CFUs для эталонной нагрузки на LBS Kan пластин (вверху) и конкурента нагрузки на пластины LBS Cam (внизу) от экспериментального лечения. Каждая строка представляет собой одну репликацию в лечении (например, R1), и коэффициент разбавления каждого места указан в верхней части пластины. Количество CfUs, подсчитанных для каждой репликации, указано справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Примерданные данные для оценки того, являются ли штаммы конкурентов неконкурентоспособной эталонной нагрузкой. (A) Доля coincubating штаммов укрывательство либо pVSV102 (темно-серый) или pVSV208 (светло-серый). R.S. указывает на эталонный штамм, а C.S. - на штамм конкурента. Dashed горизонтальная линия указывает на пропорции 0,5. Asterisk указывает на то, что эталонный штамм составлял статистически меньшую долю населения, чем напряжение конкурентов или эталонный штамм в контроле на 5 ч (Студенческий t-тест: P qlt; 0.001); нс указывает не значительные (P йgt; 0,05). (B) Регистрация относительного конкурентного индекса (RCI) для анализов coincubation. Dashed вертикальная линия указывает журнал RCI и ноль. Asterisk указывает на то, что значение RCI журнала статистически больше нуля, а контроль (Студенческий t-тест: P qlt; 0.001). Ошибки баров указать SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Выборочные данные для определения механизма конкуренции. (A) Всего CFU рассчитывает на анализы coincubation осуществляется с V. fischeri изолятов, которые были дифференимно помечены либо pVSV102 или pVSV208. CFUs были собраны в начале эксперимента (0 ч) и после 5 ч инкубации. R.S. указывает на эталонный штамм, а C.S. - на напряжение конкурентов. Dashed горизонтальная линия указывает в среднем 0 ч CFUs для обоих штаммов; звездочка указывает на эталонный штамм CFUs были статистически ниже в экспериментальном лечении по отношению к контрольному лечению на 5 ч (Студенческий t-тест: P злт; 0.002). (B) Процентное восстановление эталонного штамма. Горизонтальная пунктирной линии указывает на 100% восстановление (без увеличения или уменьшения CFUs); звездочка указывает на процентное восстановление было статистически ниже, чем 100% и контрольлечения (Студент t-тест: P злт; 0,002). Ошибки баров указать SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Примерданные данных для инкубационного времени и оптимизации изображений. (A) Всего CFUs для coincubation анализы, где CFUs были собраны в начале эксперимента (0 ч), после 5, 12 и 24 ч инкубации. R.S. указывает на эталонную деформацию, а C.S.2 указывает на штамм конкурента 2. Dashed горизонтальная линия указывает в среднем 0 ч CFUs для обоих штаммов; звездочки указывают на эталонный штамм CFUs были статистически ниже в экспериментальном лечении по сравнению с контролем лечения в данный момент времени (Студент t-тест: P злт; 0.002). Ошибки баров указать SEM. (B) Флуоресцентные микроскопии изображения, соответствующие данным CFU в панели A. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6. Выборочные данные для оптимизации коэффициента монет. Эксперименты coincubation были выполнены между эталонным штаммом (R.S.) укрывательствоp pVSV102 (зеленый, верхний ряд) и напряжением конкурента (C.S.) укрывательство pVSV208 (красный, нижний ряд) и флуоресцентные изображения микроскопии были сделаны на 24 h. (A) Штаммы были смешаны в соотношении 1:1 или (B) соотношение 1:5, где эталонный штамм, содержащий pVSV102, был превосходен по сравнению с штаммом конкурента, содержащим pVSV208. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ монетокубации, описанный выше, представляет собой мощный метод обнаружения межбактериальной конкуренции. Такой подход позволил выявить внутривидовую конкуренцию среди изолятов V. fischeri и характеристику конкурентного механизма19. Хотя описанный метод был оптимизирован для морской бактерии V. fischeri,он может быть легко модифицирован для размещения других видов бактерий, включая клинические и экологические изоляты. Важно отметить, что конкурентные механизмы частоусловно регулируются 5,6,23,24,25,26,27 , 28, таким образом, небольшие различия в условиях роста (например, тряска против постоянной культуры, температуры и т.д.) и типа носителя (например, содержание соли) может резко повлиять на результаты. Таким образом, оптимизация условий coincubation, вероятно, необходимо для различных видов бактерий, а также различных конкурентных механизмов. Лучше всего выбирать условия культуры, которые тесно отражают природную среду изолятов. Например, анализы монетокубации между штаммами V. fischeri проводились с помощью носителей LBS при температуре 24 градусов по Цельсию, с тем чтобы отразить сосудистость и температуру морской среды. Тем не менее, некоторые бактерии, естественно, компетентных в их среде27,28 и, следовательно, может занять генетический материал, выделяемый лизины клеток во время антагонистических взаимодействий29. Для предотвращения такой передачи ДНК от воздействия результатов coincubation, важно использовать условия, которые не способствуют компетентности или штаммов, которые не являются компетентными, либо естественно, либо путем инактивации механизмов поглощения ДНК. Кроме того, экспериментальные параметры, такие как фаза роста клеток, плотность культуры, время инкубации или соотношение стартовых штаммов, могут также потребовать оптимизации для различных видов бактерий или конкурентных механизмов. Например, начальная плотность культуры будет диктовать количество контакта клеток между штаммами, что может повлиять на способность бактерий развертывать контактно-зависимые механизмы конкуренции.

Рисунок 5A отображает процесс оптимизации анализов монетсации с помощью изолятов V. fischeri. Здесь был оценен ряд инкубационных времен для сбора CFU и флуоресцентной микроскопии для определения оптимального времени для сбора каждой метрики. CFUs были собраны сразу же после того, как смесь эталонного штамма и конкурента штамм 2 был замечен на LBS агар пластин (0 ч), и CFU измерений и флуоресцентных микроскопических изображений были приняты сразу и после 5, 12, и 24 ч. Эти выборочные данные подчеркивают важность тщательной оптимизации до того, как сделать какие-либо выводы о взаимодействии двух штаммов. Например, два разных вывода о механизме взаимодействия могут быть выведены на основе того, когда CFUs собраны: CFUs от 5 или 12 ч указывают штамм 2 убил эталонный штамм, в то время как CFUs, собранные на 24 ч предложить штамм 2 препятствует росту эталонный штамм.

Оптимальное время для визуализации пятен с помощью флуоресцентной микроскопии может отличаться от оптимального времени для сбора CFU. На рисунке 5B показаны флуоресцентные микроскопии изображений пятен на 0, 5, 12 и 24 ч. На 0 и 5 ч пятна монетокубации не видны с флуоресцентной микроскопией. Для изображений, сделанных на 12 ч, оба штамма в контрольной обработке видны, но RFP (ссылка штамм укрывательство pVSV208) заметно тусклым. В экспериментальной обработке на 12 h, напряжение конкурента 2 видимо (пока тускло) и напряжение справки не обнаруживается. Специфические различия между бактериальными изолятами могут влиять на экспрессию флуоресцентных белков и, таким образом, на яркость клеток в смешанном месте. Поскольку RFP заметно тусклее, чем GFP в управлении, пятна coincubation должны продолжать инкубироваться и быть изображены снова на более позднее время. На снимках, сделанных на уровне 24 ч, оба штамма заметно обнаруживаются и при одинаковой яркости в эксперименте по управлению. В экспериментальном лечении штамм 2 виден, в то время как эталонный штамм не наблюдается в месте coincubation. 15 - 24 ч инкубационного времени достаточно, чтобы визуализировать GFP и RFP для V. fischeri с использованием стабильных плазмидов pVSV102 и pVSV208, соответственно, но время инкубации может потребоваться скорректировать для различных плазмидов или бактериальных видов. Хотя оптимальное время для визуализации пятен монетисации и сбора данных CFU различны, визуализация на 24 ч является хорошим способом быстро экран взаимодействия для V. fischeri, потому что результат, полученный от изображения на 24 ч (цель видна или нет) отражает более трудоемкие количественные данные, полученные из cfus на уровне 5 или 12 ч.

Начальное соотношение может существенно повлиять на результаты, особенно при инкубации двух ингибирующих штаммов, и, возможно, потребуется скорректировать с учетом конкретных различий в эффективности убийства или темпах роста. Например, на рисунке 6А показаны флуоресцентные микроскопии экспериментов, где эталонный штамм был приобщен с самим собой (контроль) и тремя другими изолятами V. fischeri, начиная с соотношения 1:1. В этих выборочных данных эталонный штамм заметно обнаруживается при инкубации с самим собой, штаммом конкурента 1 и штаммом конкурента 3 после 24 ч. Однако, когда исходное соотношение было скорректировано до 1:5 (т.е. 50 мл эталонного штамма, смешанного с 250 мл штамма конкурента), эталонный штамм только заметно обнаруживается при совмещении с самим собой и деформации 1, что указывает на то, что как штамм 2, так и напряжение 3 эталонный штамм. Эта корректировка предотвращает более быстрые темпы роста эталонного штамма от затмения эффекта любых механизмов конкуренции помех, выставленных конкурентами штаммов. На основе результатов на рисунке 6A, соотношение 1:5 (справочный штамм : напряжение конкурента) следует использовать для проверки дополнительных штаммов V. fischeri для способности убить эталонный штамм.

Этот протокол различает чеканку штаммов с помощью дифферепригенно маркировки штаммов плазмидов, содержащих либо гены канамицина, либо хлорамфениколной резистентности. Тем не менее, различные антибиотики или другие методы отбора могут быть лучше подходят для различных видов бактерий. Другие методы для выбора дифференциального фактора могут включать: 1) использование штамма/специфической для видов auxotrophy для конкретных факторов роста (например, DAP или тимидина), 2) условные требования роста (например, один штамм растет при 37 градусах По Цельсию, а другой нет), или 3) контротбор маркеров, которые устраняют или препятствуют росту помечены штамма, когда выросли в соответствующих условиях, чтобы выразить "убить" ген (например, ccdB или мешок).

Выбор соответствующего эталонного штамма имеет решающее значение для получения и интерпретации воспроизводимых результатов из проверки coincubation. Эталонный штамм должен быть хорошо изучен (т.е. иметь широкий объем научной литературы), не иметь явной способности к убийству или ингибированию, и в идеале иметь секвенированный геном. Например, некоторые штаммы Escherichia coli являются общими эталонными штаммами для многих экспериментов по монетам30,31. Тем не менее, кишечная палочка не может быть экологически значимым для данного конкурентного механизма или конкурента, что может повлиять на результаты. Например, некоторые бактерии, возможно, развивались механизмы, специально ориентированные на близко родственные виды или конкурентов за ту же экологическую нишу, и их конкурентный механизм не был бы эффективен против штамма E. coli.

Таким образом, описанный здесь метод призван обеспечить легко модифицированный и надежный подход к оценке межбактериальных взаимодействий и конкуренции. Этот метод может быть применен к бактериальным изолятам, относящимся к экологическим или клиническим исследованиям, и может быть использован для изучения различных механизмов микробного взаимодействия, которые ранее были неизвестны или трудно исследовать.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить рецензентов за их полезную обратную связь. A.N.S. была поддержана Фондом Гордона и Бетти Мур через Грант GBMF 255.03 в Фонд исследований в области наук о жизни.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 149 интерференционная конкуренция флуоресцентная микроскопия Aliivibrio fischeri,межвидовые взаимодействия межбактериальные взаимодействия межбактериальные убийства
Coincubation Асссе для количественной оценки конкурентных взаимодействий между <em>Vibrio fischeri</em> Изоляты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Speare, L., Septer, A. N.… More

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter