Die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisationsmethode (IVIL) kann verwendet werden, um die In-vivo-Bioverteilung von Antikörpern und Antikörperkonjugaten für onkologische Zwecke in lebenden Organismen mit einer Kombination aus In-vivo-Tumor-Targeting und Ex-vivo-Immunfärbung zu untersuchen. Methoden.
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Methodenartikel
In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind wichtige Instrumente zur Krebserkennung, -diagnose und -behandlung. Sie werden verwendet, um die Rolle von Proteinen in der Tumorgenese zu entwirren, können auf Krebsbiomarker gerichtet werden, die die Erkennung und Charakterisierung von Tumoren ermöglichen, und können für die Krebstherapie als mAbs oder Antikörper-Wirkstoff-Konjugate verwendet werden, um Immuneffektorzellen zu aktivieren, Signalwege oder direkt töten Zellen, die das spezifische Antigen tragen. Trotz klinischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen durch die Komplexität und Heterogenität der Tumormikroumgebung beeinträchtigt werden. Für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika ist es daher entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats mit der lebenden Tumormikroumgebung zu bewerten. Hier beschreiben wir In Vivo Immunofluoreszenzlokalisierung (IVIL) als einen neuen Ansatz zur Untersuchung von Wechselwirkungen von Antikörper-basierten Therapeutika und Diagnostika unter den in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen. Bei dieser Technik wird ein therapeutischer oder diagnostischer Antigen-spezifischer Antikörper invivo in vivo injiziert und ex vivo mit einem sekundären Antikörper in isolierten Tumoren lokalisiert. IVIL spiegelt daher die In-vivo-Bioverteilung von Antikörper- und Targeting-Mitteln wider. Zwei IVIL-Anwendungen werden beschrieben, um die Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für die molekulare Bildgebung von Brustkrebs zu bewerten. Dieses Protokoll wird es zukünftigen Anwendern ermöglichen, die IVIL-Methode an ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anzupassen.
Einleitung
Monoklonale Antikörper (mAb) sind große Glykoproteine (ca. 150 kDa) der Immunglobulin-Überfamilie, die von B-Zellen abgesondert werden und eine primäre Funktion im Immunsystem haben, um die biologische Funktion von bakterielle oder virale Krankheitserreger und kann abnorme Proteinexpression auf Krebszellen erkennen1. Antikörper können eine extrem hohe Affinität zu ihren spezifischen Epitopen bis hin zu Femtomolarenkonzentrationen haben, was sie zu vielversprechenden Werkzeugen in der Biomedizin2macht. Mit der Entwicklung der Hybridom-Technologie durch Milstein und Köhler (Nobelpreis 1984) wurde die Produktion von mAbs mö....
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Protokoll
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) der Stanford University genehmigt.
1. Transgenes Mausmodell der Brustkrebsentwicklung
- Beobachten Sie Mäuse aus dem gewünschten Krebsmodell für das entsprechende Tumorwachstum mittels Palpation oder Sattelmessung, bevor Sie fortfahren.
HINWEIS: Hier wurde das transgene murinische Modell der Brustkrebsentwicklung (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) verwendet. Diese Tiere entwickeln spontan invasive Brustkarzinome zwischen 6 und 12 Wochen in jeder Brustdrüse20. Normale Brustdrüsen wurden al....
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Ergebnisse
Die IVIL-Methode wurde hier verwendet, um die In-vivo-Bioverteilung und Gewebeinteraktion von B7-H3-ICG und Iso-ICG zu untersuchen, indem die Wirkstoffe nach intravenöser Injektion in ein lebendes Tier 96 h mit dem Zielgewebe interagieren konnten und geerntet werden, um als primäre Antikörper während der Ex-vivo-Immunfärbung zu fungieren. Die IVIL-Methode wurde auch mit der Standard-Ex-vivo-IF-Färbung der Gewebe für den B7-H3-Marker verglichen. Normale murinische Brustdrüsen drücken den i.......
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Diskussion
Diese Methode hat mehrere kritische Schritte und erfordert potenzielle Änderungen, um eine erfolgreiche Implementierung sicherzustellen. Erstens müssen die Dosierung und das Timing der intravenösen Injektion von Antikörper/Antikörperkonjugat auf die jeweilige Anwendung zugeschnitten sein. Im Allgemeinen sollten Dosierungen verwendet werden, die mit der Art und Weise übereinstimmen, wie das Antikörperkonjugat typischerweise verwendet wird, d. h. passende Dosierungen des therapeutischen Antikörpers oder des Antikörper-basi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) für Diskussionen und den Einsatz von Geräten. Wir danken Dr. Jürgen K. Willmann für seine Betreuung. Diese Studie wurde durch das NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA1118681 Training Grant (KEW) und NIH K99EB023279 (KEW) unterstützt. Der Stanford Neuroscience Microscopy Service wurde von NIH NS069375 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Weibchen, Alter 4-6 Wochen |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Katheter | VisualSonics | Bitte rufen Sie an, um zu bestellen | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alkohol-Tücher | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Mullschwämme (4" x 4" 16-lagig) | Cardinal Health | 2913 | |
| Wärmelampe | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isofluran | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Augensalbe | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Chirurgisches Klebeband | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Einweg-Basisformen | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimale Schnitttemperatur (OKT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Chirurgische Londoner Zange | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Chirurgische Schere | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antikörper | |||
| AlexaFluor-488 Anti-Ratte für Ziegen IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 Anti-Kaninchen-IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 Anti-IgG für Ziegen | Life Technologies | A11014 | |
| IgG-Isotyp-Kontrolle beim Menschen | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanisierter Anti-Netrin-1-Antikörper | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Kaninchen Anti-Maus CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Klon |
| Ratte Anti-Maus CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Klon |
| Reagenzien | |||
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Klarlack Polen | Jede örtliche Drogerie | ||
| Indocyanin Grün - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS Ester | |
| Eindeckmedium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normales Ziegenserum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| steriles Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhäsionsglas-Objektträger | VWR | 48311-703 | |
| Entsalzungssäulen | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glas-Deckgläser | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobe Barriere Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Objektträger-Färbetablett | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
Referenzen
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.
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Nachdrucke und Genehmigungen
