Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Resumen

Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de³²P.

Resumen

La secuenciación extensa del genoma entero ha identificado muchos marcos de lectura abiertos (ORF) que proporcionan muchas proteínas potenciales. Estas proteínas pueden tener funciones importantes para la célula y pueden desentrañar nuevos procesos celulares. Entre las proteínas, las quinasas son los principales actores, ya que pertenecen a las vías de señalización celular y tienen la capacidad de activar o desactivar muchos procesos cruciales para el destino de la célula, como el crecimiento celular, la división, la diferenciación, la motilidad y la muerte.

En este estudio, nos centramos en una nueva proteína quinasa potencial, LIMK2-1. Demostramos su existencia por Western Blot usando un anticuerpo específico. Evaluamos su interacción con una proteína reguladora aguas arriba utilizando experimentos de coinmunoprecipitación. La coinmunoprecipitación es una técnica muy potente capaz de detectar la interacción entre dos proteínas diana. También se puede utilizar para detectar nuevos socios de una proteína de cebo. La proteína de cebo puede ser purificada ya sea a través de una etiqueta diseñada para su secuencia o a través de un anticuerpo dirigido específicamente a ella. Estos complejos proteicos pueden separarse por SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidGel Gel) e identificarse mediante espectrometría de masas. El LIMK2-1 inmunoprecipitado también se utilizó para probar su actividad de quinasa in vitro mediante el etiquetado de ATP de³²P. Este ensayo bien establecido puede utilizar muchos sustratos diferentes, y las versiones mutadas del cebo se pueden utilizar para evaluar el papel de residuos específicos. Los efectos de los agentes farmacológicos también pueden evaluarse ya que esta técnica es altamente sensible y cuantitativa. No obstante, el manejo de la radiactividad requiere especial precaución. La actividad de la quinasa también puede evaluarse con anticuerpos específicos dirigidos al grupo fosfo del aminoácido modificado. Este tipo de anticuerpos no están disponibles comercialmente para todos los residuos modificados fosfo.

Introducción

Durante muchas décadas, numerosas vías de señalización se han aclarado y su participación en procesos celulares cruciales como la división celular, diferenciación, motilidad, muerte celular programada, inmunidad y neurobiología, se ha demostrado. Las quinasas desempeñan un papel importante en estas vías de señalización, ya que a menudo regulan finamente su activación o inactivación y forman parte de complejos versátiles transitorios que responden a estímulos externos^1,2,3. La mutación y la desregulación de las quinasas a menudo conducen a enfermedades en los seres humanos, y ....

Protocolo

1. Preparación celular para la transfección

ADVERTENCIA: Todos los pasos del cultivo celular deben realizarse en un laboratorio dedicado, y las células se manipulan dentro de un gabinete microbiológico de clase 2.

1. Células de semilla HEK-293 (riñón embrionario humano) en placas de 10 cm en 10 ml de DMEM (medio de águilas modificadas de Dulbecco) suplementadas con 10% de suero fetal. Cultivo durante 3 a 5días por debajo del 5% co2, a 37 oC, hasta que las células alcancen una confluencia del 90 %.
2. Tratar placas de 10 cm con colágeno R para aumentar la adhesión celular a las placas de plástico.
   1. Añadir 5 ml....

Resultados

La proteína LIMK2-1 se sintetiza
LIMK2-1 se menciona en los bancos de datos, pero hasta ahora sólo un documento ha demostrado la existencia de su ARNm¹⁸. En comparación con sus dos homólogos, LIMK2a y LIMK2b, LIMK2-1 tiene un dominio C-terminal adicional identificado como un dominio inhibidor de la fosfatasa 1 de la proteína (PP1i). Diseñamos un anticuerpo que apunta a un péptido de este dominio, los aminoácidos 671-684 (Figura

Discusión

En este documento, hemos utilizado herramientas bioquímicas robustas para caracterizar a nivel molecular una nueva proteína, LIMK2-1, que se cree que es una quinasa basada en su secuencia y en sus homólogos, LIMK2a y LIMK2b^20.

En primer lugar, demostramos la existencia de LIMK2-1 a nivel proteico utilizando el análisis de Western Blot con un anticuerpo específico. Después de esto, evaluamos su interacción con la quinasa ascendente ROCK1, que se sabe que regula LIMK2a y .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-actina	Sigma-Aldrich	A1978	para Western Blot
Anticuerpo anti-c-Myc	Invitrogen	MA1-21316	para Western Blot
Anticuerpo anti-cofilina	Tecnología de señalización celular	3312/5175	para Western Blot
Anticuerpo anti-GFP	Santa Cruz	sc-9996	para Western Blot
Anticuerpo anti-HA	Roche Ciencia Aplicada	11687423001	para Western Blot
Anticuerpo anti-fosfo-cofilina	Tecnología de señalización celular	3313	para Western Blot
Anticuerpo Anti-PP1i	Eurogentec	diseñado para este estudio	para Western Blot
Aprotinina	Euromedex	A-162B	para tampón de lisis
ATP	Invitrogen	PV3227	para γ[ 32P] etiquetado
γ[ 32P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	para γ[ 32P] etiquetado
Solución salina tamponada BES	Sigma-Aldrich	14280	para transfección
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422	para lisis y tampón de quinasa
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	para Laemmli
BSA	Sigma-Aldrich	A3059	para tampón
de bloqueoAzul de bromofenol	Sigma-Aldrich	B0126	para Laemmli
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	para transfección
Centrífuga	Sigma	111-541
Colágeno R	Pan Biotech	P06-20166	para la transfección
Control siRNA	Ambion	AM4611	para la especificidad del
anticuerpo PP1iCoomassie PageBlue solución de tinción de proteínas	Thermo-Fisher	24620	para tinción en gel
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	para tampón de lisis
Unidad de electroforesis	Biorad	Mini-Protean	para Western
Blot EZview Gel de afinidad rojo anti-HA	Sigma-Aldrich	E6779	para inmunoprecipitación
Software GeneSys	Ozyme		para la adquisición de Western Blot
Software GeneTolls	Ozyme		para la cuantificación de Western Blot
Gránulas de trampa GFP	Chromtek		para inmunoprecipitación
Glycine	Euromedex	26-128-6405	para tampón de transferencia
GST-cofilina	Señalización celular Upstate	12-556	para γ[ Etiquetado 32P]
Jeringa Hamilton 100 mL	Hamilton	710	para eliminar cuidadosamente el sobrenadante de las perlas sin aspirarlas
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	para tampón de quinasa
Software ImageQuant TL	GE Healthcare		para la adquisición y cuantificación de radiactividad
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	para PP1i especificidad del anticuerpo
Leupeptina	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	para lisis y tampón de quinasa
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	para γ[ 32P] Etiquetado
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	para tampón de quinasa
MnCl2	Sigma-Aldrich	244589	para tampón de quinasa
NaCl	Euromedex	1112	para lisis y tampón de quinasa
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	para lisis y tampón de quinasa
Okaidic ácido	Euromedex	0-2220	para tampón de lisis
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	para tampón de lisis y quinasa
p-nitrofenilfosfato	Euromedex	1026	para tampón de lisis
membrana de PVDF Immobillon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 tamaño de poro 0,45 mm	para Western Blot
Rueda giratoria	Labinco		para incubación de bolas
Cerradura de seguridad eppendorf	Eppendorf	0030120.086	para ensayo de quinasa
SDS	Sigma-Aldrich	5030	para Laemmli y tampón de migración
Ortovanadato de sodio	LC Laboratories	S8507	para tampón de lisis y quinasa
Pirofosfato de sodio	Fluka	71501	para tampón de lisis
Super Signal West	Dura Protein Biology	34075	para Western Blot
Syngene Pxi	Ozyme		para Western Blot
Extractos de tejidos	Biochain	P1234035 Cerebro P12345152 Pulmón P1234149 Hígado P1234188 Páncreas P1234260 Testículo	para el análisis de Western Blot
Unidad de transferencia	Biorad	Mini-Trans-Blot	para Western Blot
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	para tampón de lisis
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	para tampón de bloqueo
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		para leer la autorradiografía
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		para leer la autorradiografía
Papel Whatman	GE Healthcare	3030-672	para Western Blot