Lo scopo di questo metodo è quello di generare un modello in vivo di angiogenesi tumorale xenotrapianto di cellule tumorali dei mammiferi in un embrione di pesce zebra che ha vasi sanguigni etichettati fluorescentmente. Esaminando lo xenotrapianto e i vasi associati, è possibile ottenere una misurazione quantitativa della risposta angiogenica.
L’angiogenesi tumorale è un obiettivo chiave della terapia anti-cancro e questo metodo è stato sviluppato per fornire un nuovo modello per studiare questo processo in vivo. Uno xenotrapianto di pesce zebra viene creato impiantando cellule tumorali dei mammiferi nello spazio perivitelline di due giorni dopo la fecondazione degli embrioni di pesce zebra, seguito misurando l’entità della risposta angiogenica osservata in un endpoint sperimentale fino a due giorni post-impianto. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di quantizzare con precisione la risposta angiogenica dell’ospite del pesce zebra all’innesto. Ciò consente un esame dettagliato dei meccanismi molecolari e del contributo ospite vs tumorale alla risposta angiogenica. Gli embrioni xenointrapsi a possono essere sottoposti a una varietà di trattamenti, come l’incubazione con potenziali farmaci anti-angiogenesi, al fine di studiare strategie per inibire l’angiogenesi tumorale. La risposta angiogenica può anche essere live-immagine al fine di esaminare processi cellulari più dinamici. La tecnica sperimentale relativamente poco impegnativa, i costi di manutenzione a basso costo del pesce zebra e la breve linea temporale sperimentale rendono questo modello particolarmente utile per lo sviluppo di strategie per manipolare l’angiogenesi tumorale.
L’angiogenesi è uno dei segni distintivi classici del cancro e rappresenta un obiettivo della terapia anti-cancro1,2. Per studiare questo processo, sono stati creati modelli di xenotrapianto di cancro impiantando cellule tumorali di mammiferi in animali come i topi3. È stato inoltre sviluppato un modello di xenotrapianto di pesce zebra, che prevede l’impianto di cellule tumorali in 2 giorni dopo la fecondazione (dpi) pesce zebra che si traduce in una rapida crescita dei vasi sanguigni del pesce zebra nello xenotrapianto4.
Questo protocollo descrive un modello di xenotrapianto dell’embrione di pesce zebra in vivo in cui la risposta angiogenica può essere quantificata con precisione nell’intero xenotrapianto. Questo metodo consente allo sperimentatore di esaminare, in vivo, i meccanismi molecolari alla base della risposta angiogenica tumorale. La trattatibilità genetica del pesce zebra permette di interrogare il contributo dell’ospite, mentre la selezione didiverse linee cellulari tumorali permette di esaminare anche il contributo del tumore all’angiogenesi 5,6,7. Inoltre, poiché le larve di pesce zebra sono permeabili a piccole molecole, è possibile utilizzare inibitori specifici della via o vagliare le librerie di farmaci per identificare nuovi inibitori dell’angiogenesi tumorale8,9,10, 11.
Il modello xenotrapianto embrionale di zebra presenta vantaggi unici rispetto ad altri modelli di xenotrapianto mammifero. Gli xenografi di pesce zebra sono più economici e più facili da eseguire, è possibile esaminare un gran numero di animali e l’imaging delle cellule vive consente un esame dettagliato del comportamento cellulare4. A differenza di altri modelli in vivo, che richiedono fino a diverse settimane per osservare una crescita significativa del vaso, l’angiogenesi negli xenografi del pesce zebra può essere osservata entro 24 h dopo l’impianto3,4. Tuttavia, la mancanza di un sistema immunitario adattivo nel pesce zebra embrionale, pur conile nel mantenimento dello xenotrapianto, significa che la risposta immunitaria adattativa e il suo contributo all’angiogenesi tumorale non possono essere esaminati. Inoltre, la mancanza di cellule stromali tumorali, l’incapacità di impiantare ortotopicamente il tumore e la differenza di temperatura di mantenimento tra il pesce zebra e le cellule dei mammiferi sono potenziali punti deboli di questo metodo. Ciò nonostante, l’amenabilità di questo modello per l’imaging dal vivo e la capacità di quantificare con precisione la risposta angiogenica lo rende particolarmente vantaggioso per lo studio dei processi cellulari che regolano l’angiogenesi tumorale in vivo.
Il primo passo critico nel protocollo è l’impianto delle cellule tumorali. È essenziale che le cellule vengano iniettate in un luogo che consenta allo xenotrapianto di impiantare con successo nell’embrione senza rendere l’embrione edematoso. Un’iniezione troppo anteriore può permettere alle cellule di muoversi verso il cuore, bloccando il flusso sanguigno e portando all’edema, mentre un’iniezione troppo posteriore si tradurrà in uno xenotrapianto impiantato male. Un’iniezione anteriore è meglio evitare inserendo l’a…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Alhad Mahagaonkar per aver gestito la struttura di pesce zebra dell’Università di Auckland e l’Unità di Ricerca Biomedica Imaging, Scuola di Scienze Mediche, Università di Auckland, per assistenza nella microscopia confocale time-lapse. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di progetto del Consiglio per la ricerca sanitaria della Nuova èelanda (14/105), una sovvenzione per il progetto Marsden Fund (UOA1602) della Royal Society of Neozelandese e una sovvenzione per il progetto Auckland Medical Research Foundation (1116012) assegnato a J.W.A.
Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |