Analyse d'activité sans anticorps pour l'analyse de l'activité de méthyltransferase d'ARN

Résumé

Ici, un analyse in vitro sans anticorps pour l'analyse directe de l'activité de méthyltransferase sur l'ARN synthétique ou in vitro transcrit est décrit.

Résumé

Il y a plus de 100 modifications chimiquement distinctes de l'ARN, dont les deux tiers se composent de méthylations. L'intérêt pour les modifications de l'ARN, et en particulier les méthylations, est réapparu en raison des rôles importants joués par les enzymes qui les écrivent et les effacent dans les processus biologiques pertinents à la maladie et au cancer. Ici, un analyse in vitro sensible pour l'analyse précise de l'activité d'auteur de méthylation d'ARN sur les ARN transcrits synthétiques ou in vitro est fourni. Cet exemple utilise une forme tritiée de S-adenosyl-méthionine, résultant en l'étiquetage direct de l'ARN méthylé avec du tritium. La faible énergie du rayonnement tritium rend la méthode sûre, et les méthodes préexistantes d'amplification du signal de tritium, permettent de quantifier et de visualiser l'ARN méthylé sans l'utilisation d'anticorps, qui sont généralement sujettes aux artefacts. Bien que cette méthode soit écrite pour la méthylation de l'ARN, peu de réglages le rendent applicable à l'étude d'autres modifications de l'ARN qui peuvent être étiquetées radioactivement, comme l'acétylation d'ARN avec ¹⁴C coenzyme acétyle A. Dans l'ensemble, cet essai permet d'évaluer rapidement l'ARN conditions de méthylation, l'inhibition avec les inhibiteurs de petites molécules, ou l'effet de l'ARN ou des mutants enzymatiques, et fournit un outil puissant pour valider et élargir les résultats obtenus dans les cellules.

Introduction

L'ADN, l'ARN et les protéines sont sujets à des modifications qui régulent étroitement l'expression des gènes¹. Parmi ces modifications, les méthylations se produisent sur les trois biopolymères. L'ADN et les protéines méthylations ont été très bien étudiés au cours des trois dernières décennies. En revanche, l'intérêt pour la méthylation de l'ARN n'a été relancé que récemment à la lumière des rôles importants que les protéines qui écrivent, effacent ou lient les méthylations de l'ARN jouent dans le développement et la maladie². En plus de fonctions mieux connues dans l'abondante ribosomal et le transfert RNAs, voies de ....

Protocole

1. Transcription in vitro et purification de gel de l'ARN cible

1. Clonez la séquence d'intérêt en plasmides contenant des promoteurs T7 et/ou SP6 en utilisant des techniques de clonage moléculaire établies¹² ou des kits.
2. La linéarisation du modèle d'ADN pour la transcription in vitro
   1. Amplifiez la séquence d'intérêt par PCR du plasmide avec des amorces conçues pour inclure la région de promoteur T7 par l'insertion, 20-30 bp en amont et en aval comme décrit précédemment¹³.
   2. Vous pouvez également digérer 5 g de plasmide à l'aide d'un site de coupe en zymace (RE) disponi....

Résultats

Réaction de transcription in vitro
Figure 2 A représente une course typique d'une réaction de transcription in vitro avec la polymérase d'ARN T7 du snRNA 7SK, qui est un ARN relativement court (331 nt) et très structuré. Comme le montre cette image brute, il existe plusieurs bandes indésirables, à la fois plus courtes et plus longues que 7SK, résultant probablement d'événements aléatoires d'initiation transcriptionnelle ou de terminaison. Pour cette raiso.......

Discussion

Ici, une méthode simple et robuste pour la vérification in vitro de l'activité de méthyltransferase d'ARN vers des transcriptions spécifiques est rapportée. L'analyse profite du fait que la méthionine de S-adenosyl peut être tritiaté sur le donneur de groupe méthyle (figure 1), permettant que l'ARN méthylé soit détecté avec précision sans l'utilisation d'anticorps. Cependant, il est important de noter que cet essai ne peut pas indiquer quel résidu ou groupe chimique est méthylé par l'enzyme........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Échelle d’ADN 10 bp	Invitrogen	10821-015	Kit d’échelle d’ADN 10 pb.
10 % de persulfate d’ammonium (APS)	S.O.	S.O	Pour un gel de polyacrylamide dénaturant l’urée (Pour 10 mL, dissoudre 1 g dans 8 mL d’eau milliQ ; ajuster le volume à 10 mL avec de l’eau milliQ ; filtrer la solution à l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’un molleton de 0,45 & m filtre).
10X Tampon TBE	N/A	N/A	Pour le gel de polyacrylamide dénaturant l’urée (Pour 1L, ajouter 108 g de Tris Base, 55 g d’Acide Borique dans un cylindre muni d’un agitateur ; ajouter 800 mL d’eau distillée et laisser dissoudre ; ajouter 40mL de 0,5 M de Na2EDTA (pH 8,0) ; ajuster le volume à 1L avec de l’eau milliQ ; filtrer la solution à l’aide d’un 0,22µ ; m filtre).
10X TBS	N/A	N/A	Pour 1L, ajouter 60,5 g de Tris Base, 87,6 g de NaCl dans un cylindre muni d’un agitateur ; ajouter 800 mL d’eau distillée et laisser dissoudre ; ajuster le pH à 7,5 avec du HCl concentré ; ajuster le volume à 1L avec de l’eau milliQ ; filtrer la solution à l’aide d’un 0,22 µ ; m filtre.  ;
Acrylamide : Bis-Acrylamide 29:1 (solution à 40 %/électrophorèse), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	Pour gel de polyacrylamide dénaturant l’urée.
L’ADÉNOSYL-L-MÉTHIONINE, S-[MÉTHYL-3H] ; (SAM[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	Pour la méthylation in vitro de l’ARN ; Concentration = 1,0 mCi/mL ; Activité spécifique = 17,1 Ci/mmol ; Molarité= (1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 µ ;M.  ;   ; À la réception du tube 3H-SAM congelé, décongelez-le à 4° ; C, faire 20 & micro ; L aliquotes, et congelez-les à -30° ;C. Ne jamais recongeler et réutiliser une aliquote partiellement utilisée.
Amersham Hypercassette Cassettes d’autoradiographie	GE Healthcare	RPN11649	Pour l’exposition au gel d’autoradiogramme.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	Pour l’exposition au gel d’autoradiogramme.
Compteur de scintillation	Beckman	LS6500	Pour le comptage de scintillation liquide.
Biorad Mini système d’électrophorèse horizontale	Biorad	1704466	Mini système d’électrophorèse horizontale.
cOmplete Mini Inhibiteur de protéase sans EDTA Cocktail	Roche Applied Science	4693159001	Pour une solution 20X, dissoudre 1 comprimé dans 0,525 mL d’eau sans nucléase.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	Cassette vide sans RNase pour gel de polyacrylamide.
Cassettes vides Criterion Biorad		1656001	Cellule d’électrophorèse verticale au format midi.
Spectrophotomètre microvolume DeNovix DS-11 Spectrophotomètre	DeNovix	DS-11-S	pour mesurer la concentration d’ADN et d’ARN.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	Pour le comptage par scintillation liquide.
Fisherbrand 7 mL Flacons à scintillation en PEHD	Fisher	03-337-1	Pour le comptage par scintillation liquide.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer	RPI CORP	112600	Pour le prétraitement du gel d’autoradiogramme.
Séchoir à gel	Biorad	1651745	Pour le séchage du gel.
Gel Loading Buffer II	Ambion	AM8547	Pour le chargement de l’ARN dans un gel d’urée polyacrylamide dénaturant (composition : 95 % de formamide, 18 mM d’EDTA et 0,025 % de SDS, de xylène cyanol et de bleu de bromophénol).
Conseils d’excision de gel jetable GeneCatcher	Gel Company	NC9431993	Pour retirer les bandes des gels d’agarose et de polyacrylamide.
Kit Megascript	Ambion	AM1333	Pour la transcription in vitro avec l’ARN polymérase T7.  ;
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (transparent)/ NC9965364 (noir)	Boîte de coloration en gel.
pRZ	Addgene	#27663	Plasmide pour la production de transcrits in vitro avec des extrémités homogènes
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	Pour le nettoyage de l’ARN, utilisez le protocole modifié fourni dans le protocole.
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Kit pour l’extraction sur gel et le nettoyage de fragments d’ADNdb utilisés pour la transcription in vitro.
Saran Premium Plastic Wrap Saran	Wrap	Amazon	Pour le gel de séchage.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Colorant gel d’acide nucléique ultra sensible.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Colorant de gel d’acide nucléique.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA disodique, pH 8,0
TEMED	Fisher	110-18-9	Pour gel de polyacrylamide dénaturant l’urée.
Thermomélangeur avec SMARTBLOCK 24X 1,5 mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	Pour l’incubation à température contrôlée de tubes de 1,5 mL.
TOPO TA Cloning Kit	life technologies		Kits pour le clonage rapide de la Taq polymérase&ndash ; produits de PCR amplifiés en vecteurs contenant des promoteurs T7 et/ou SP6 pour la transcription in vitro de l’ARN.
TURBO DNase (2 U&frasl ; et micro ; L)	Ambion	AM2238	Pour l’élimination de l’ADN des réactions de transcription in vitro.
Urea	Sigma	51456-500G	Pour gel de polyacrylamide dénaturant l’urée.
Papier Whatman 3MM	GE Healthcare	3030-154	Papier de chromatographie pour gel de séchage.

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