Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

Sommario

Qui, viene descritto un saggio in vitro privo di anticorpi per l'analisi diretta dell'attività di metiltransferasi sull'RNA transscritto sintetico o in vitro.

Abstract

Ci sono più di 100 modifiche chimicamente distinte dell'RNA, due terzi delle quali consistono di metilazioni. L'interesse per le modifiche dell'RNA, e in particolare le metilazioni, è riemerso a causa dei ruoli importanti svolti dagli enzimi che li scrivono e li cancellano nei processi biologici rilevanti per la malattia e il cancro. Qui, viene fornito un saggio in vitro sensibile per un'analisi accurata dell'attività degli autori di metilazione dell'RNA sugli RNA trascritti sintetici o in vitro. Questo saggio utilizza una forma tritiata di S-adenosyl-methionine, con conseguente etichettatura diretta dell'RNA metilato con trizio. La bassa energia della radiazione di trizio rende il metodo sicuro, e i metodi preesistenti di amplificazione del segnale di trizio, consentono di quantificare e visualizzare l'RNA metilato senza l'uso di anticorpi, che sono comunemente inclini a manufatti. Mentre questo metodo è scritto per la metilazione dell'RNA, poche modifiche lo rendono applicabile allo studio di altre modifiche dell'RNA che possono essere etichettate radioattivamente, come l'acetilazione dell'RNA con coenzima acetil ¹⁴C A. Nel complesso, questo saggio consente di valutare rapidamente l'RNA condizioni di metilazione, inibizione con piccoli inibitori molecolari, o l'effetto di mutanti di RNA o enzimi, e fornisce un potente strumento per convalidare ed espandere i risultati ottenuti nelle cellule.

Introduzione

Il DNA, l'RNA e le proteine sono soggetti a modifiche che regolano strettamente l'espressione genica¹. Tra queste modifiche, le metilazioni si verificano su tutti e tre i biopolimeri. Le metilazioni del DNA e delle proteine sono state studiate molto bene negli ultimi tre decenni. Al contrario, l'interesse per la metilazione dell'RNA è stato riacceso solo di recente alla luce dei ruoli importanti che le proteine che scrivono, cancellano o legano le metilazioni dell'RNA giocano nello sviluppo e nella malattia². Oltre alle funzioni più conosciute negli ABbondanti RNA ribosomici e di trasferimento, le vie di metilazione dell....

Protocollo

1. Trascrizione in vitro e purificazione del gel dell'RNA bersaglio

1. Clonare la sequenza di interesse in plasmidi contenenti promotori T7 e/o SP6 utilizzando tecniche di clonazione molecolare stabilite¹² o kit.
2. Linearizzazione del modello di DNA per la trascrizione in vitro
   1. Amplificare la sequenza di interesse da parte della PCR del plasmide con primer progettati per includere la regione Promotore T7 attraverso l'inserto, 20-30 bp a monte e a valle come descritto in precedenza¹³.
   2. In alternativa, digerire 5 g del plasmico utilizzando un enzima di restrizione (RE) si....

Risultati

Reazione di trascrizione in vitro
Figura 2 A rappresenta una tipica esecuzione da una reazione di trascrizione in vitro con la polimerasi t7 RNA dello snRNA 7SK, che è relativamente breve (331 nt) e RNA altamente strutturato. Come mostrato in quell'immagine grezza, ci sono più bande indesiderate, sia più brevi che più lunghe di 7SK, probabilmente risultanti da eventi di inizio o terminazione trascrizionali casuali. Per questo motivo, la purificazione del .......

Discussione

Qui, viene riportato un metodo semplice e robusto per la verifica in vitro dell'attività di metiltransferasi dell'RNA verso trascrizioni specifiche. Il saggio sfrutta il fatto che la methionina S-adenosil può essere tritiata sul donatore del gruppo metilico (Figura 1), consentendo di rilevare con precisione l'RNA metilato senza l'uso di anticorpi. Tuttavia, è importante notare che questo saggio non può indicare quale residuo o gruppo chimico è metilato dall'enzima. Per identificare o verific.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA Ladder kit.
10% di persolfato di ammonio (APS)	N/A	N/A	Per il gel di poliacrilammide denaturante dell'urea (Per 10 mL, sciogliere 1 g in 8 mL di milliQ di acqua; regolare il volume a 10 mL con milliQ di acqua; filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 10 mL dotata di 0,45 µ m filtro).
10X TBE Buffer	N/A	N/A	Per il gel di poliacrilammide denaturante dell'urea (Per 1 litro, aggiungere 108 g di Tris Base, 55 g di acido borico in un cilindro con una barra di agitazione; aggiungere 800 ml di acqua distillata e lasciare sciogliere; aggiungere 40 ml di Na2EDTA 0,5 M (pH 8,0); regolare il volume a 1 litro con milliQ di acqua; filtrare la soluzione con un 0,22µ m filtro).
10X TBS	N/A	N/A	Per 1 litro, aggiungere 60,5 g di Tris Base, 87,6 g di NaCl in un cilindro con ancoretta di agitazione; aggiungere 800 ml di acqua distillata e lasciare sciogliere; regolare il pH a 7,5 con HCl concentrato; regolare il volume a 1 litro con acqua milliQ; filtrare la soluzione con un microacido 0,22; filtro m.
Acrilammide: bis-acrilammide 29:1 (soluzione al 40%/elettroforesi), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	Per gel di poliacrilammide denaturante dell'urea.
ADENOSIL-L-METIONINA, S-[METIL-3H]; (SAM[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	Per la metilazione in vitro dell'RNA; Concentrazione = 1,0 mCi/mL; Attività specifica = 17,1 Ci/mmol; Molarità= (1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 µM.    Al ricevimento del tubo 3H-SAM congelato, scongelarlo a 4 gradi; C, fare 20 µ L aliquote e congelarle a -30°C. Non ricongelare e riutilizzare mai un'aliquota parzialmente utilizzata.
Cassette per autoradiografia per ipercassetta Amersham	GE Healthcare	RPN11649	Per l'esposizione al gel per autoradiogramma.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	Per l'esposizione al gel per autoradiogramma.
Contatore di scintillazione Beckman	Beckman	LS6500	Per il conteggio della scintillazione liquida.
Biorad Mini Sistema di Elettroforesi Orizzontale	Biorad	1704466	Mini Sistema di Elettroforesi Orizzontale.
cOmplete Mini Compresse da cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche Applied Science	4693159001	Per una soluzione 20X, sciogliere 1 compressa in 0,525 ml di acqua priva di nucleasi.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	Cassetta vuota senza RNasi per gel di poliacrilammide.
Criterion cassette vuote Biorad		1656001	Cella di elettroforesi verticale in formato midi.
Spettrofotometro per microvolumi DeNovix DS-11 Spettrofotometro	DeNovix	DS-11-S	per la misurazione della concentrazione di DNA e RNA.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	Per il conteggio della scintillazione liquida.
Fisherbrand Fiale di scintillazione in HDPE da 7 ml	Fisher	03-337-1	Per il conteggio della scintillazione liquida.
Potenziatore per autoradiografia ad azione rapida Fluoro-Hance,	RPI CORP	112600	Per il pretrattamento con gel per autoradiogramma.
Essiccatore di gel	Biorad	1651745	Per asciugare il gel.
Tampone di caricamento su gel II	Ambion	AM8547	Per caricare l'RNA in gel di poliacrilammide urea denaturante (composizione: 95% formammide, 18 mM EDTA e 0,025% SDS, xilene cianolo e blu di bromofenolo).
Punte per escissione in gel monouso GeneCatcher	Gel Company	NC9431993	Per rimuovere le bande dai gel di agarosio e poliacrilammide.
Kit Megascript	Ambion	AM1333	Per la trascrizione in vitro con RNA polimerasi T7.
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (trasparente)/ NC9965364 (nero)	Scatola per colorazione in gel.
pRZ	Addgene	#27663	Plasmide per la produzione di trascritti in vitro con estremità omogenee
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	Per la pulizia dell'RNA, utilizzare il protocollo modificato fornito nel protocollo.
Kit di estrazione del gel QIAquick (50)	Qiagen	28704	Kit per l'estrazione del gel e la purificazione del frammento di dsDNA utilizzato per la trascrizione in vitro.
Saran Premium Plastic Wrap	Saran Wrap	Amazon	Per gel essiccante.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Colorante in gel di acido nucleico ultra sensibile.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Colorante in gel di acido nucleico.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA disodico, pH 8,0
TEMED	Fisher	110-18-9	Per gel di poliacrilammide denaturante dell'urea.
Thermomixer con SMARTBLOCK 24X 1,5mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	Per l'incubazione a temperatura controllata di provette da 1,5 mL.
TOPO TA Kit di clonazione	tecnologie di vita		Kit per la clonazione rapida della Taq polimerasi... prodotti di PCR amplificati in vettori contenenti promotori T7 e/o SP6 per la trascrizione dell'RNA in vitro.
TURBO DNase (2 U⁄ µ L)	Ambion	AM2238	Per la rimozione del DNA da reazioni di trascrizione in vitro.
Urea	Sigma	51456-500G	Per gel di poliacrilammide denaturante dell'urea.
Carta Whatman 3MM	GE Healthcare	3030-154	Carta per cromatografia per gel essiccante.

per microvolumi