المجهرية الخلوية التفاعلية للتحقيق في توطين البروتين تحت الخلوي والتغيرات في الخلايا المورفولوجية في البكتيريا

ملخص

توفر هذه المقالة دليل خطوه بخطوه للتحقيق في ديناميات التعريب الخلوية البروتينية ومراقبه التغييرات المورفولوجية باستخدام المجهر عالي الدقة الفلورية في العصي الفرعية والمكورات العنقودية الذهبية.

الملخص

وعاده ما يتم اجراء التحقيقات في العوامل التي تؤثر علي انقسام الخلايا وشكل الخلية في البكتيريا بالاقتران مع المجهر الفلوري عالي الدقة حيث ان الملاحظات التي تتم علي مستوي السكان قد لا تعكس حقا ما يحدث علي مستوي خليه واحده. يسمح المجهر الزمني للخلايا الحية للمحققين بمراقبه التغيرات في انقسام الخلايا أو الشكل الخلوي الذي يوفر رؤى قيمه فيما يتعلق بالتوطين دون الخلوي للبروتينات وتوقيت التعبير الجيني ، كما يحدث ، للمساعدة المحتملة في الاجابه علي الاسئله البيولوجية الهامه. هنا ، ونحن وصف البروتوكول لدينا لرصد التغيرات الظاهرية في عصيه سوتيلليس والمكورات العنقودية الذهبية باستخدام المجهر عاليه الدقة تفكيك. والهدف من هذا التقرير هو توفير بروتوكول بسيط وواضح يمكن ان يعتمده المحققون الآخرون المهتمون باجراء تجارب المجهر الفلوري لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في البكتيريا وكذلك الكائنات الحية الأخرى.

المقدمة

وقد تم تعزيز مجال بيولوجيا الخلايا البكتيرية بشكل كبير من خلالالتطورات الاخيره في تقنيات^{المجهر 1,2}. ومن بين الاداات الأخرى ، تظل المجاهر القادرة علي اجراء تجارب المجهر الضوئي المضفية الزمنيه وسيله قيمه. ولذلك فمن غير المستغرب ان المجهر الفلوري لا تزال شعبيه بين علماء البيولوجيا الخلايا الميكروبية. الاضافه إلى إظهار الأنماط الظاهرية النهائية ، فان تقديم معلومات عن كيفيه ظهور الأنماط الظاهرية الملحوظة باستخدام المجهر الزمني يمكن ان يضيف قيمه كبيره إلى النتائج ويحتمل ان يقدم أدله عن العمليات الخلوية التي تستهدفها المرشحات المحتملات للادويه⁴.

البروتوكول

1-ظروف النمو العامة

1. تطعيم 2 مل من متوسط النمو المناسب تستكمل مع المضادات الحيوية (عند الاقتضاء) مع مستعمره واحده من سلاله (ق) ان يكون المصابين بالإجهاد. احتضان هذه الثقافات البذور بين عشيه وضحيها في 22 درجه مئوية في حاضنه الاهتزاز.
   ملاحظه: يتم توفير شروط النمو البكتيرية المحددة المستخدمة في هذه المقالة تحت قسم النتائج التمثيلية.
2. تمييع الثقافات بين عشيه وضحيها 1:20 في وسائل الاعلام الطازجة في قارورة 125 mL ، تكمله مع المضادات الحيوية (عند الاقتضاء).
3. تنمو الثقافة (ق) في 37 درجه مئوية في حاضنه الاهتزاز حتى منتصف لوغاريتمي المرحلة (OD₆₀₀ = 0.5).
   ملاحظه: يمكن أضافه المحفز أو المثبط مباشره إلى الثقافة المتنامية (ق) في مرحله الن....

النتائج

الأنماط الظاهرية GpsB
سابقا لقد أظهرنا ان Sa-GpsB هو بروتين أساسي كما استنفاد GpsB باستخدام النتائج الحمض الريبي النيبالي انتيسنس في الخلية تحلل⁹. هنا نوضح كيف يمكن التقاط ظهور مختلف الأنماط الظاهرية لتقسيم الخلايا والتغيرات في توطين البروتين باستخدام بروتوكول المجهر الزمني الذي تم وصفه في هذه المقالة. ولهذا الغرض ، فان سلالات s. RB143 [SH1000 إيواء pEPSA5 (ناقل فارغ)] و GGS8 [SH1000 إيواء pGG59 (P_xyl-gpsb^تحسيس<.......

المناقشة

وظل المجهر عمادا في الدراسات المتعلقة بالكائنات الميكروبية. النظر إلى حجم خلايا الميكرون ، فان الدراسات علي مستوي الخلية الواحدة تعتمد تقليديا علي المجهر الكتروني (EM). علي الرغم من ان EM أصبحت تقنيه قويه جدا في السنوات الاخيره ، فان لديها حدودها الذاتية الخاصة بالاضافه إلى وصول المستخدم محدوده¹⁶. وقد وفرت التحسينات في تقنيات المجهر الفلوري وتطوير تحقيقات الفلورسنت المختلفة ، مثل FDAA³، علماء البيولوجيا الخلايا الميكروبية مع مجموعه واسعه من الاداات لدراسة مختلف العمليات الخ.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الكواشف الحيوية	Agarose	BP160-100	درجة البيولوجيا الجزيئية - الفحص المجهري
منخفض EEO DAPI	Invitrogen	D3571
FM4-64	Invitrogen	T3166	المجهر
طبق سفلي زجاجي	MatTek	P35G-1.5-14-C	مجهر
IPTG	فيشر الكواشف الحيوية	BP1755-10	خالية
مجهر	GE	DeltaVision Elite	حامل مجهر مقلوب Olympus IX-71 مخصص ؛ برج الإضاءة المخصص ووحدة إضاءة الضوء المنقولة. الأهداف: PLAPON 60X (NA 1.42 ، WD 0.15 مم) ؛ زيت OLY 100X (NA 1.4 ، WD 0.12 مم) ؛ DIC Prism Nomarski لهدف 100X ؛ كاميرا CoolSnap HQ2 ؛ جمعية مباحث أمن الدولة 7 ألوان ؛ غرفة التحكم البيئي - غير شفافة.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ
SoftWorx	GE		التصوير المقدم من الشركة المصنعة

Fisher من الديوكسانمانع برنامج