Cet article fournit un guide étape par étape pour étudier la dynamique de localisation sous-cellulaire des protéines et pour surveiller les changements morphologiques à l'aide de la microscopie à haute résolution de fluorescence dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.
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Article de méthode
Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les études des facteurs influençant la division cellulaire et la forme cellulaire chez les bactéries sont couramment effectuées en conjonction avec la microscopie à haute résolution de fluorescence, car les observations faites au niveau de la population peuvent ne pas vraiment refléter ce qui se produit à un seul niveau cellulaire. La microscopie en accéléré en cellule vive permet aux chercheurs de surveiller les changements dans la division cellulaire ou la morphologie cellulaire qui fournissent des informations précieuses sur la localisation subcellulaire des protéines et le moment de l'expression des gènes, comme il arrive, pour potentiellement aider à répondre à d'importantes questions biologiques. Ici, nous décrivons notre protocole pour surveiller les changements phénotypiques dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus utilisant un microscope de deconvolution à haute résolution. L'objectif de ce rapport est de fournir un protocole simple et clair qui peut être adopté par d'autres chercheurs intéressés à mener des expériences de microscopie à fluorescence pour étudier différents processus biologiques chez les bactéries ainsi que d'autres organismes.
Introduction
Le domaine de la biologie cellulaire bactérienne a été considérablement amélioré par les progrès récents dans les techniques de microscopie1,2. Entre autres instruments, les microscopes capables de mener des expériences de microscopie à fluorescence en timelapse demeurent un outil précieux. Les chercheurs peuvent surveiller divers événements physiologiques en temps réel à l'aide de protéines fluorescentes telles que les fusions transcriptionnelle et translationnelle de la protéine fluorescente verte (GFP), les acides fluorescents D-amino (FDAA)3, ou utiliser d'autres taches pour étiquet....
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Protocole
1. Conditions générales de croissance
- Inoculer 2 ml de milieu de croissance approprié complété par des antibiotiques (si nécessaire) avec une seule colonie de la souche à imager. Incuber ces cultures de semences pendant la nuit à 22 oC dans un incubateur secouant.
REMARQUE : Les conditions de croissance bactérienne spécifiques utilisées dans cet article sont fournies sous la section des résultats représentatifs. - Diluer les cultures de nuit 1:20 dans les médias frais dans un flacon de 125 ml, compléter avec des antibiotiques (si nécessaire).
- Cultiver la culture (s) à 37 oC dans un incubateur secouant jusqu'à la phase mi-logarithmique (O....
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Résultats
Phénotypes GpsB
Précédemment nous avons montré que Sa-GpsB est une protéine essentielle comme épuisement du GpsB utilisant un ARN antisens a comme conséquence la lyse cellulaire9. Ici nous décrivons comment l'émergence de divers phénotypes de division cellulaire et des changements dans la localisation de protéine pourraient être capturés utilisant le protocole de microscopie de timelapse décrit dans cet article. À cette fin, S. aureus souches RB143 [SH1000 hébergeant p.......
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Discussion
La microscopie est restée un pilier dans les études relatives aux organismes microbiens. Compte tenu de la taille des cellules à l'échelle du micron, les études sur le niveau d'une seule cellule ont traditionnellement été utilisées sur la microscopie électronique (EM). Bien que l'EM soit devenue une technique assez puissante ces dernières années, elle a ses propres limites intrinsèques en plus de l'accès limité des utilisateurs16. Les améliorations apportées aux techniques de microscopie à fluores.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leurs commentaires sur cet article. Ces travaux ont été financés par une subvention de démarrage de l'Université de Floride du Sud (PE).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Biologie moléculaire Qualité - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopie |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopie |
| Plat à fond en verre | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopie |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Sans |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Support de microscope inversé ; Tour d’éclairage personnalisée et module d’éclairage à lumière transmise. Objectifs : PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm) ; HUILE OLY 100X (N.A. 1,4, WD 0,12 mm) ; Prisme DIC Nomarski pour objectif 100X ; Appareil photo CoolSnap HQ2 ; Assemblage SSI 7 couleurs ; Chambre de contrôle de l’environnement - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | Inhibiteur de FtsZ |
| SoftWorx | GE | Logiciel d’imagerie fourni par le fabricant |
Références
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in ....
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Réimpressions et autorisations
