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Genetics

Microréseaux d'ADN et d'ARN à haute densité - Synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques d'acide nucléique

Published: August 12, 2019 doi: 10.3791/59936
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Inorganic Chemistry, Faculty of Chemistry, University of Vienna

Summary

Dans cet article, nous présentons et discutons de nouveaux développements dans la synthèse et les applications des microarrays d'acide nucléique fabriqués in situ. Plus précisément, nous montrons comment les protocoles de synthèse de l'ADN peuvent être étendus à l'ARN et comment les microréseaux peuvent être utilisés pour créer des bibliothèques d'acide nucléique récupérables.

Abstract

La photolithographie est une technique puissante pour la synthèse des oligonucléotides d'ADN sur des lames de verre, car elle combine l'efficacité des réactions d'accouplement de phosphoramidite avec la précision et la densité de la lumière UV réfléchie par des miroirs de la taille d'un micromètre. La photolithographie produit des microréseaux pouvant accueillir des centaines de milliers jusqu'à plusieurs millions de séquences d'ADN différentes, 100-nt ou plus, en seulement quelques heures. Avec cet espace séquence très important, les microréseaux sont des plates-formes idéales pour explorer les mécanismes des interactions entre l'acide nucléique et ligand, qui sont particulièrement pertinentes dans le cas de l'ARN. Nous avons récemment rapporté sur la préparation d'un nouvel ensemble de phosphoramidites d'ARN compatibles avec la photolithographie in situ et qui ont été plus tard employés pour cultiver des oligonucléotides d'ARN, des homopolymères aussi bien que des séquences de base mélangée. Ici, nous animons en détail le processus de fabrication du microréseau d'ARN, de la conception expérimentale, à la configuration instrumentale, à la synthèse du tableau, à la déprotection et à l'analyse finale de l'hybridation à l'aide d'un modèle 25mer séquence contenant les quatre bases à titre d'exemple. En parallèle, nous allons au-delà des expériences basées sur l'hybridation et exploitons la microlithographie comme une passerelle peu coûteuse vers des bibliothèques complexes d'acide nucléique. Pour ce faire, les microréseaux d'ADN à haute densité sont fabriqués sur un monomère sensible à la base qui permet à l'ADN d'être facilement clivé et récupéré après synthèse et déprotection. Le protocole de fabrication est optimisé de façon à limiter le nombre d'erreurs synthétiques et, à cet effet, une couche de solution de carotène est introduite pour absorber les photons UV qui pourraient autrement se refléter sur les substrats de synthèse. Nous décrivons étape par étape le processus complet de préparation de la bibliothèque, de la conception au clivage et à la quantification.

Introduction

L'utilisation pratique des microréseaux d'ADN a traditionnellement été dans l'étude des variations dans les niveaux d'expression des gènes entre deux populations cellulaires, en utilisant des brins complémentaires et la fluorescence comme méthode de détection1. De temps en temps, les microarrays d'ADN s'aventurent dans des événements de liaison avec des ligands d'acide non nucléique, tels que des protéines, avec une stratégie de permutation systématique de séquence qui offre un aperçu complet du paysage de liaison2,3, 4,5. Cette approche transforme efficacement les microréseaux de simples surfaces d'hybridation en plates-formes à large couverture de séquences, ce qui serait un atout pour l'étude du monde plus riche et plus complexe de la structure et de la fonction de l'ARN. Soutenu par la réaction extrêmement efficace de couplage de phosphoramidite6, les tableaux d'ADN synthétisés in situ peuvent maintenant également être considérés comme une source bon marché d'ADN7, qui devient particulièrement pertinent compte tenu de la demande toujours croissante pour Matériel d'acide nucléique pour l'assemblage des gènes8,9, nanostructures à base d'ADN10, stockage d'informations ou de séquençage11,12. De même, les technologies de séquençage sont susceptibles de bénéficier du développement de méthodes qui produisent des mélanges très complexes d'oligonucléotides d'ARN13. Dans ce contexte, les protocoles de fabrication de tableaux qui permettent de synthétiser in situ et à haute densité des oligonucléotides sont idéalement placés pour répondre aux besoins du domaine en pleine expansion de la biotechnologie de l'acide nucléique. Cependant, avec un domaine aussi diversifié que la biotechnologie, le but de chaque application peut exiger que l'ADN sur microarray soit produit à haut débit ou avec une très faible quantité d'erreurs synthétiques14,15, ou les deux, nécessitant un regarder de plus près les protocoles de synthèse des microréseaux d'ADN qui, historiquement, ont été principalement optimisés pour les essais d'hybridation. Pendant ce temps, la synthèse in situ des microréseaux d'ARN s'est avérée être une entreprise difficile, avec la plupart de la difficulté associée au groupe de protection pour la fonction 2'-OH, habituellement un moiety silyl dans la synthèse standard de phase solide qui est enlevée avec réactifs à base de fluor, des produits chimiques incompatibles avec les surfaces de verre ou de silicium. Ces questions et les défis dans l'ADN et la synthèse des microréseaux d'ARN ont récemment fait l'objet d'un grand nombre de travaux, en particulier avec l'approche photolithographie16.

La photolithographie utilise la lumière UV pour débloquer les oligonucléotides avant le couplage et nécessite des masques pour construire un modèle d'exposition aux UV, organisant et contrôlant ainsi spatialement la croissance des oligonucléotides. Les masques physiques ont été remplacés par des micromiroirs contrôlés par ordinateur dont l'inclinaison réfléchit sélectivement la lumière UV sur le substrat de microarray17,18,19. Comme source UV, nous utilisons 365 nm de lumière à partir d'une source LED de haute puissance20. Les configurations photolithographiques actuelles sont équipées de réseaux de micromiroirs contenant 1024 à 768 miroirs, correspondant à plus de 780 000 points adressables individuellement (« caractéristiques ») sur une petite surface de seulement 1,4 cm2, ou 1080p avec des tableaux de 1920 à 1080, ou 2 millions de miroirs. Chacun des miroirs de l'appareil a donc un contrôle direct sur la séquence cultivée sur la fonction correspondante. À l'exception de la lumière UV, la photolithographie fonctionne comme une technique de synthèse en phase solide et adopte la chimie de la phosphoramidite à base de cycle. Seulement il exige une stratégie de protection entièrement différente pour que la synthèse d'ARN réussisse. Nous avons développé une nouvelle série de phosphoramidites à ARN sensibles à la lumière portant des groupes protecteurs hydrazine-labile21. Ces monomères permettent de déprotéger l'ARN dans des conditions douces qui n'affectent pas l'intégrité de la surface. Une première étape de déprotection utilise la triéthylamine pour éliminer les groupes de protection du phosphodiester cyanoéthyle, tandis que l'hydrazine est utilisée dans une deuxième étape distincte pour enlever ceux des fonctions de l'amine 2'-OH et exocyclique. Ce faisant, l'ARN oligonucléotides de 30-nt de longueur et de n'importe quelle séquence peut maintenant être synthétisé in situ sur microarrays22,23. En parallèle, nous avons également récemment commencé à aborder les questions de débit, de qualité et de vitesse dans la photolithographie de l'ADN et de l'ARN. Nous avons mesuré l'efficacité du couplage à 99 % pour tous les amidites d'ADN et d'ARN (Figure 1) et étudié chaque étape individuelle du cycle d'allongement de l'oligonucléotide, du temps d'oxydation au choix de l'activateur et à l'exposition optimale aux UV24 , 25. Nous avons introduit de nouveaux groupes de protection de 5' sensibles à la lumière qui peuvent être supprimés en quelques secondes seulement, transformant la synthèse de centaines de milliers de 100mers en un processus de quelques heures26. Nous avons également doublé le débit de fabrication de tableau en exposant deux substrats simultanément27. Enfin, nous avons introduit un dT phosphoramidite contenant un groupe de succinyl sensible à la base comme un moyen pratique de couper, recueillir et analyser l'ADN et l'ARN oligonucléotides, qui est au cœur de la préparation de la bibliothèque28.

En dépit de l'aspect relativement banal de l'ADN et de la synthèse de phase solide d'ARN, particulièrement pour des chimistes d'acide nucléique, la photolithographie de microarray demeure une mise à niveau non triviale exigeant une configuration complexe, le contrôle soigneux et la surveillance du processus, et instructions distinctes pour la manipulation post-synthétique en fonction de la nature de l'oligonucléotide et du type d'application. Dans cet article, nous souhaitons fournir une présentation détaillée de l'ensemble de la procédure étape par étape de la synthèse in situ des microréseaux d'ADN et d'ARN par photolithographie, de la conception expérimentale à l'analyse des données, en mettant l'accent sur la préparation des instruments et Consommables. Nous décrivons ensuite les méthodes de déprotection post-synthétiques qui correspondent à l'objectif visé par la fabrication de microréseaux (c.-à-d. l'hybridation ou la récupération des bibliothèques d'acide nucléique).

Protocol

1. Conception de microarray

  1. Écrivez les séquences à synthétiser dans un éditeur de texte, 5'3', une ligne par séquence. Pour le contrôle de qualité 25mer, utilisez la séquence "GTCATCATCATCATGAACCACCCTGGTC". Utilisez des lettres A, C, G et T pour les nucléotides d'ADN et des numéros 5, 6, 7 et 8 pour les nucléotides à ARN.
  2. Dans le cas de la préparation de la bibliothèque, ajouter un numéro supplémentaire (c.-à-d. 9) à la fin de 3' de chaque séquence. Cela correspondra à l'accouplement du monomère sensible à la base.
  3. Chaque séquence doit être suivie d'une virgule. Attribuez un nom à chaque séquence après la virgule et vérifiez que chaque voie suit le format [séquence,#sequence_name] (sans parenthèses). Enregistrer la liste des séquences comme un fichier .txt.
  4. Démarrer MatLab puis charger le programme ChipDesign.m. Exécutez le programme.
  5. Dans la fenêtre Du panneau de propriété, chargez le fichier de mise en page EntireChip microarray. Chargez le fichier de mise en page MilliChip si l'objectif est de synthétiser l'ensemble du tableau à quatre endroits identiques.
  6. Dans la fenêtre Du panneau de propriété, sous la spécificationde puce, sélectionnez Sélectionner le conteneur puis zone de synthèse. Sous Pattern, sélectionnez le modèle qui donne la quantité correcte de fonctionnalités adressables, en comptant le nombre de séquences et le nombre de répliques. Pour le contrôle de qualité 25mer, sélectionnez le modèle 25:36.
  7. Sous Select Container, sélectionnez Fiducial. Les caractéristiques fiduciales sont généralement synthétisées aux coins de la zone de synthèse et sont utilisées pour extraire des données d'hybridation. Avec Fiducial sélectionné, écrivez une séquence (5'3') qui sera synthétisée sur des caractéristiques fiduciales et qui peut agir comme un contrôle positif. Pour l'expérience 25mer, utilisez la même séquence d'ADN.
  8. Sous Séquence, chargez le fichier texte contenant toutes les séquences écrites. Assurez-vous que Randomize est sélectionné. Donnez un titre à l'expérience dans Project Title et, dans Linker Sequence, écrivez TTTTT (correspondant à un lien T5).
  9. Appuyez sur Générer, puis trouver les fichiers de conception de tableau et des masques (Figure 2) sous MaskGen-delta-rc1/Designs dossier. Assurez-vous qu'il contient un scriptd'affichage, une séquence de flux et un fichier de conception.
  10. Pour la préparation de la bibliothèque, ouvrez le script d'affichage. Ajoutez une ligne supplémentaire au bas du script d'affichage qui copie exactement la première ligne du script (par exemple, afficher First-Mask.bmp 150). Cela supprimera le groupe de photoprotection terminale à la fin 5' de tous les oligonucléotides.
  11. Démarrer le programme AutoJob créateur d'emploi, charger un modèle en cliquant sur Le modèlede charge , puis cliquez sur le script d'affichage pour charger le fichier script d'affichage qui a été généré par MatLab. Appuyez sur Générer. Cette étape créera une série d'instructions, appelées jobfile, qui contrôleront la communication de l'ordinateur avec les micromiroirs et le synthétiseur d'ADN.

2. Préparation et fonctionnalisation des diapositives

  1. Percer une diapositive à deux positions correspondant à l'emplacement de l'inlet et de la tuyauterie de sortie sur la cellule de synthèse. Utilisez un morceau de diamant de 0,9 mm sur un routeur CNC pour forer avec précision et fiabilité. Rincer les toboggans forés avec de l'eau ultrapure et les disposer dans un toboggan.
  2. Nettoyez les surfaces en soniquant les toboggans dans un bain d'eau contenant 5 % d'un nettoyant à usage spécial à base d'ammoniac pendant 30 min à 35 oC. Rincer la glissière à l'air double distillé H2O et les transférer dans une grille propre et sèche.
  3. Disposer les lames de microscope forées et non forées dans un maquet. Dans un grand cylindre gradué, préparez la solution de fonctionnalisation en mélangeant 475 ml d'éthanol (EtOH) avec 25 ml de ddH2O, 10 g de réactif silanisant (N -(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide) et 1 ml d'acide acétique. Bien remuer jusqu'à ce qu'il soit homogène, puis transférer dans un contenant convenable et fermé.
  4. Placer la grille chargée dans le récipient, fermer le couvercle et laisser le récipient basculer doucement sur un shaker orbital pendant 4 h à température ambiante.
  5. Après 4 h, jeter la solution de fonctionnalisation et remplacer par 500 ml de solution de lavage, composée de 475 ml d'EtOH, 25 ml de ddH2O et 1 ml d'acide acétique. Agiter lentement pendant 20 min à température ambiante, puis jeter et remplacer par 500 ml de solution de lavage frais.
  6. Après 20 min supplémentaires à température ambiante, jetez la solution, séchez les lames avec un jet d'argon et séchez-les dans un four à vide préchauffé à 120 oC. Après 2 h, éteindre le four et la pompe à vide, mais laisser les glissières sous pression réduite pendant la nuit. Ensuite, ramener le four à la pression atmosphérique et conserver les lames dans un dessiccateur jusqu'à une utilisation ultérieure.

3. Préparation des réactifs de synthèse et des réactifs

  1. Porter les poudres de phosphoramidite (figure 1) de leur température de stockage (-25 ou -45 oC) à la température ambiante dans un dessiccateur.
  2. Lorsque les phosphoramidites ont atteint la température ambiante, dissoudre la poudre avec un volume d'acétonitrile ultra-sec (lt;30 ppm H2O) afin d'atteindre 30 mM de concentration pour les phosphoramidites standard d'ADN et d'ARN, et 50 mM pour le monomère dT sensible à la base ( préparation de la bibliothèque). Ajouter un petit sac de tamis moléculaire pour piéger toute trace d'humidité.
  3. Préparer une solution de 1% (w/w) imidazole dans DMSO en dissolvant 11 g d'imidazole en 1 L de DMSO sec. Bien agiter jusqu'à dissolution complète. Attachez la solution au port auxiliaire du synthétiseur d'ADN. Ce sera le solvant d'exposition nécessaire pour l'enlèvement complet du groupe de protection de 5.-photoprotecting.
  4. Pour la synthèse des bibliothèques, préparez une solution de 1 % (w/v) en dichlorométhane en dissolvant 100 mg de carotène en 10 ml de dichlorométhane. Bien agiter dans une bouteille en verre ambre puis envelopper dans du papier d'aluminium.

4. Préparation et suivi de la synthèse des microréseaux.

  1. Enregistrez la température et l'humidité dans la salle de fabrication du microréseau et assurez-vous que le synthétiseur d'ADN est soumis à une pression suffisante à l'hélium.
  2. Allumez l'UV-LED et son ventilateur de refroidissement. Fixez un compteur d'intensité UV au plan focal de la lumière UV entrante et allumez-le (Figure 3A).
  3. Sur l'ordinateur, démarrer le logiciel de contrôleur de fichiers jobfile/micromirror/synthèse (nommé WiCell). Activez puis initialisez l'appareil micromiroir et chargez un fichier de masque entièrement blanc en cliquant à droite sur DMD,puis en sélectionnant l'image de charge .
  4. Cliquez à droite sur l'icône UVS et sélectionnez UV Shutter Open. Lire la valeur de puissance (en mW/cm2) sur le compteur d'intensité et compter 60 s. Après 60 s, relisez la valeur de puissance et notez les valeurs de début et de fin. Fermez l'obturateur en sélectionnant l'obturateur UV Fermer et éteignez le compteur d'intensité. Calculer la valeur moyenne de l'intensité UV en mW/cm2.
  5. Calculez le temps d'exposition nécessaire pour atteindre une énergie radiante de 6 J/cm2 pour la photodéprotection 5'-NPPOC (microréseaux d'ADN et Equation 1 d'ARN) et 3 J/cm2 pour 5'-BzNPPOC photodeprotection (bibliothèques d'ADN), simplement après la relation.
  6. Dans le logiciel de station de synthèse d'ADN, créez un fichier de séquence dans l'éditeur de séquence s'il copie et colle le contenu de la séquence de flux générée par MatLab. Ajoutez deux étapes de lavage supplémentaires à la fin de 3' (lettre de cycle par défaut: "s") pour laver la surface des substrats avant de passer au premier couplage. Enregistrer et exporter le fichier séquence.
  7. Dans l'éditeur de protocole du logiciel Workstation, créez un protocole qui contient un cycle dédié nommé d'après chacune des lettres et numéros présents dans le fichier de séquence (par exemple, si un fichier de séquence contient uniquement des lettres A, C, G et T, alors le fichier de protocole doit contiennent quatre cycles, nommés A, C, G et T).
  8. Fixez le temps de couplage pour les phosphoramidites d'ADN (cycles A, C, G et T) à 15 s, à 120 s pour la phosphoramidite rU (cycle 8) et à 300 s pour les phosphoramidites rA, rC et rG (cycles 5, 6 et 7). Pour la préparation de la bibliothèque, définir le couplage du monomère dT sensible à la base et clevabable à 2 à 120 s (tableau 1 et tableau 2).
  9. Assurez-vous que le temps d'attente entre deux événements de communication Event 2 Out dans chaque cycle correspond au temps d'exposition UV calculé pour atteindre l'énergie radiante nécessaire. En ce qui concerne le fichier de séquence, enregistrer et exporter le fichier de protocole.
  10. Dans le logiciel WiCell, chargez les fichiers de travail, de séquence et de protocole dans leurs sous-fenêtres respectifs, puis cliquez sur Envoyer pour envoyer les fichiers de séquence et de protocole au synthétiseur d'ADN.
  11. Dans le fichier séquence, comptez le nombre d'accouplements pour chaque phosphoramidite.
  12. Pour mesurer le volume requis (en L) de solution de phosphoramidite nécessaire pour effectuer chaque synthèse, multipliez le nombre d'accouplements par 60. Ajouter 250 L à chaque volume pour la sécurité et l'amorçage de la ligne sur le synthétiseur d'ADN. Utilisez un volume de base de 250 l pour les phosphoramidites nécessitant un seul couplage.
  13. Transférez rapidement la solution dans les flacons du synthétiseur d'ADN correspondant à la lettre/numéro de port dans les cycles de protocole.
  14. Premier les ports avec les solutions de phosphoramidite avec 10 impulsions de premier ordre chacunafin de remplir les lignes avec réactif. Primer la ligne de lavage acétonitrile avant d'attacher la cellule de réaction.
  15. Pour assembler la cellule de synthèse, placez d'abord un joint épais (250 m) de perfluoroelastomère (FFKM) sur le bloc de quartz de la cellule. Placez une glissière de microscope forée et fonctionfonctionnelle sur le dessus du premier joint et vérifiez que les trous sur les glissières se connectent à l'entonne et à la sortie de la cellule de synthèse.
  16. Placer un deuxième joint de polytétrafluoroéthylène (PTFE) mince (50 m) au-dessus de la glissière forée, entourant les deux trous. Enfin, placez une deuxième diapositive fonctionnelle mais non forée au sommet du deuxième joint (figure 3B). Placez un cadre métallique à 4 vis sur le dessus de la cellule à double substrat assemblée et serrez la vis à la même force de serrage (0,45 Nm) à l'aide d'un tournevis de couple.
  17. Fixez l'entonneet et la tuyauterie de sortie au synthétiseur d'ADN. Alignez la ligne de lavage acétonitrile et vérifiez le bon débit de l'acétonitrile (ACN) à travers les substrats. Démonter et remonter la cellule si une fuite d'ACN peut être observée à ce stade. Mesurer le volume d'ACN à la ligne de déchets après avoir passé par 7 cycles d'amorçage ACN. Ce volume doit être de 2 ml.
  18. Fixez la cellule de synthèse au plan focal de la lumière UV entrante. Dans le cas de la préparation de la bibliothèque, attachez une ligne d'arrivée et de sortie supplémentaire à l'arrière de la cellule et remplissez la chambre arrière avec la solution de carotène (2 ml de solution est suffisante). Assurez-vous qu'il n'y a pas de fuite (Figure 3C).
  19. Démarrez la synthèse en cliquant d'abord sur Run dans le logiciel WiCell. Lors de la première commande WAIT dans le fichier de travail, appuyez sur Démarrer sur le synthétiseur d'ADN.
  20. Lors de la synthèse, vérifiez régulièrement que l'affichage des fichiers de masque coïncide avec l'exposition aux UV et l'ouverture de l'obturateur.
  21. Après la synthèse des microréseaux réguliers, déconnecter la cellule du synthétiseur, démonter la cellule et utiliser un stylo diamant pour émousser le numéro de synthèse sur les diapositives en verre. Etch le nombre sur la face non synthétisée de chaque diapositive. Transférer les lames dans des tubes centrifugeuses de 50 ml et les conserver dans une zone desséchée jusqu'à ce qu'ils soient utilisés davantage.
  22. Après la synthèse des microréseaux de bibliothèque, drainer d'abord la solution de carotène de la chambre, puis la laver en coulant de 2 à 5 ml de CH2Cl2, puis égoutter. Procéder avec le démontage par étape 4.21. Le tableau synthétisé peut être visible à l'œil nu (Figure 4).

5. Déprotection du microréseau D'ADN

  1. Remplir un pot en verre taché de 20 ml d'EtOH et de 20 ml d'éthylènediamine (EDA). Placez les microréseaux à ADN seulement verticalement dans le bocal, fermez le couvercle et laissez les glissières pour les déprotéger pendant 2 h à température ambiante.
    CAUTION : L'AED est un liquide hautement toxique, corrosif et inflammable. Travaillez avec des gants dans une hotte de fumée bien aérée.
  2. Après 2 h, récupérer les diapositives à l'aide d'une pince à épiler et les rincer soigneusement à l'aide de H2O à double distillation.
  3. Séchez les glissières dans une centrifugeuse microarray pendant quelques secondes, puis entreposez-les dans un dessiccateur.

6. Déprotection de microréseau d'ARN

  1. Dans un tube centrifugeur de 50 ml, préparer une solution sèche de 2:3 triéthylamine/ACN (20 ml et 30 ml de chacune, respectivement). Transférer une diapositive de microarray d'ARN dans le tube de centrifugeuse, fermer le couvercle puis envelopper avec du film d'étanchéité en plastique. Agiter doucement le tube de centrifugeuse sur un shaker orbital pendant 1h et 30 min à température ambiante.
  2. Après 1h et 30 min, retirer la lame, laver avec 2 à 20 ml d'ACN sec puis sécher dans une centrifugeuse microarray pendant quelques secondes.
    CAUTION : La triéthylamine est un liquide hautement toxique, corrosif et inflammable. L'acétonitrile est toxique et inflammable. Travaillez avec des gants dans une hotte de fumée bien aérée.
    REMARQUE : Première étape de déprotection terminée.
  3. Préparer une solution d'hydrate d'hydrazine de 0,5 M en 3:2 pyridine/acide acétique. Tout d'abord, mélanger 20 ml d'acide acétique et 30 ml de pyridine dans un cylindre gradué. Attendez que la solution refroidisse avant d'ajouter 1,21 ml d'hydrate d'hydrazine. Transférer environ 40 ml de la solution résultante dans un tube de centrifugeuse de 50 ml.
    CAUTION : L'hydrate d'hydrazine est un liquide extrêmement toxique et corrosif. La pyridine est très inflammable et extrêmement toxique. L'acide acétique est inflammable et corrosif. Travaillez avec des gants dans une hotte de fumée bien aérée.
  4. Après la première étape de déprotection, transférer la glissière d'ARN dans la solution d'hydrate d'hydrazine, fermer le couvercle et envelopper avec du film d'étanchéité en plastique. Secouez doucement le tube sur un shaker orbital pendant 2 h à température ambiante. Après 2 h, retirer la lame, laver avec 2 à 20 ml d'ACN sec puis sécher dans une centrifugeuse à microarray pendant quelques secondes.
    REMARQUE : Deuxième étape de déprotection complète.
  5. Si le microréseau d'ARN contient également des nucléotides d'ADN, procédez à une troisième étape de déprotection. Dans un tube centrifugeuse de 50 ml, mélanger 20 ml d'EDA avec 20 ml d'EtOH. Ajouter le microréseau ADN/ARN à la solution 1:1 EDA/EtOH et laisser à température ambiante pendant 5 min.
  6. Après 5 min, retirer la lame, laver avec 2 à 20 ml d'eau stérile, puis sécher dans une centrifugeuse microarray et conserver dans un dessiccateur.

7. Hybridation avec un brin complémentaire étiqueté fluorescent

  1. Décongeler l'albumine de sérum bovin acétylée (10 mg/mL) et le brin complémentaire étiqueté Cy3 (100 nM) et réchauffer à température ambiante.
  2. Dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 ml, mélanger 150 mL de tamponMES 2x (200 mM 2-( N-morpholino)ethanesulfonic acide; 1,8 M NaCl; 40 mM EDTA; 0,02% Tween-20) avec 26,7 'L d'ADN étiqueté Cy3, 13,4 'L de BSA acétylée et 110 'L de sterile H2O Mix. Vortex. Doubler le volume si les deux diapositives doivent être utilisées pour l'hybridation.
  3. Préchauffez un four d'hybridation à une température inférieure au Tm du duplex, mais assez haut pour assurer une bonne discrimination entre les séquences de match complet et non-match. Pour le contrôle de qualité 25mer, fixer latempérature à 42 oC (Tm de 59 oC).
  4. Placez soigneusement une chambre d'hybridation auto-adhésive de 300 l au-dessus de la zone de synthèse sur chaque diapositive et pipet dans la solution d'hybridation préparée ci-dessus. Couvrir les trous de la chambre avec des points adhésifs et envelopper la glissière entière dans du papier d'aluminium.
  5. Placez la glissière de microarray dans le four d'hybridation, couvrez-la et laissez-la tourner doucement à la température d'hybridation sélectionnée pendant 2 h.
  6. Après 2 h, détacher la lame, retirer le papier d'aluminium et arracher soigneusement la chambre d'hybridation. Transférer les lames dans un tube de centrifugeuse contenant 30 ml de tampon de lavage non-stringent (NSWB; 0,9 M NaCl, 0,06 M phosphate, 6 mM EDTA, 0,01% Tween20, pH 7,4) et secouer vigoureusement pendant 2 min à température ambiante.
  7. Transférer la glissière dans un tube de centrifugeuse contenant 30 ml de tampon de lavage rigoureux (SWB; 100 mM MES, 0,1 M NaCl, 0,01% Tween20) et secouer vigoureusement pendant 1 min.
  8. Enfin, transférer la glissière dans un tube de centrifugeuse contenant 30 ml de tampon de lavage final (FWB; 0,1x citrate salin de sodium) et secouer pendant quelques secondes. Séchez la lame dans une centrifugeuse microarray.
  9. Placez le microréseau sec, zone de synthèse vers le bas, dans le porte-diapositives du scanner microarray. Pour les duplex étiquetés Cy3, scannez à une résolution de 5 m avec une longueur d'onde d'excitation de 532 nm, un filtre de 575 nm et un photomultiplicateur de 350. Enregistrer l'analyse haute résolution comme fichier d'image .tif (Figure 5A).

8. Extraction et analyse de données

  1. Avant l'extraction des données, faites pivoter l'analyse du tableau enregistré dans un éditeur d'images afin de situer la plus longue chaîne de caractéristiques fiduciales dans le coin supérieur gauche de l'analyse. Enregistrer l'image en rotation.
  2. Démarrer NimbleScan, puis appuyez sur Fichier ( Ouvrez et chargez l'analyse du tableau. Puis, en cliquant sur Parcourir dans la sous-section de fichier de conception, charger le . ndf fichier de conception qui a été automatiquement généré lors de la conception de l'expérience microarray. Ensuite, cliquez sur Ouvrez.
  3. En vue, cliquez sur Auto Contrast/Brightness. Cliquez sur l'icône Alignez manuellement au-dessus de l'analyse. Placez quatre marqueurs en forme de carré aux quatre coins de l'analyse, puis cliquez à nouveau sur l'icône maintenant verte. Extraire les données d'hybridation en cliquant sur Analyse, Rapports puis Rapport de sonde.
  4. Ouvrez le . fichier de rapport de sonde dans un éditeur de feuille de calcul. Conserver les colonnes B et I et jeter le reste avant de procéder au calcul des valeurs moyennes et de l'écart type par rapport aux données extraites (Figure 5B).

9. Déprotection de la bibliothèque, clivage et récupération

  1. Pour déprotéger et couper les bibliothèques d'ADN, préparez une solution de 1:1 EDA/toluène sec dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Immerger la glissière dans la solution de clivage, fermer la glissière et envelopper avec du film d'étanchéité en plastique, puis tourner doucement dans un shaker orbital pendant 2 h à température ambiante.
  2. Après 2 h, retirer la lame et laver à l'eau avec 2 à 20 ml d'ACN scrupuleusement sec. Retirez la glissière et laissez-la sécher à l'air.
  3. À l'eau, appliquez 100 oL de H2O stérile sur la zone de synthèse désormais discernable. Pipet la solution de haut en bas à quelques reprises avant de le transférer dans un tube de microcentrifuge de 1,5 ml. Répétez le processus et combinez le microarray éluder dans le même tube (Figure 6).
  4. Évaporez les 2 à 100 l de copeaux échappant à la sécheresse, puis rédissolvez-les en 10 oL de H2O sans nucléane. Mesurez l'absorption sur un spectrophotomètre UV-Vis.
  5. Détalez la bibliothèque d'ADN sur une pointe de pipette de 10 l équipée de résine C18. Tout d'abord, transformer la puce élutiser en une solution tampon de 0,1 M triéthylammonium acétate (TEAA).
  6. Mouillez la résine en aspirant 3 x 10 'L de H2O/ACN 1:1, et équilibrez la résine en lavant avec 3 x 10 'L de 0,1 M TEAA tampon. Lier l'ADN en pipetting la puce élutiser 10 fois de haut en bas à travers la résine. Laver la résine avec 3 x 10 l de 0,1 M de tampon TEAA, 3 x 10 oL de H2O.
  7. Éluter l'ADN dessalé de la pointe en lavant la résine avec 10 oL de H2O/ACN 1:1. Séchez la solution dessalée vers le bas et rédissolvez-la en 10 oL de H2O stérile. Mesurez l'absorption sur un spectrophotomètre UV-Vis (Figure 7). Évaporer la bibliothèque à la sécheresse et le stocker à -20 oC jusqu'à ce qu'il soit utilisé davantage.

Representative Results

Hybridation de microréseau d'ADN et d'ARN
La figure 5 montre les résultats d'un test d'hybridation effectué sur un microréseau contenant les versions ADN et ARN d'une séquence 25mer (5'-GTCATCATCATCACACACCCTGGTC-3' sous forme d'ADN). L'analyse de la figure 5A apparaît dans un format à échelle verte correspondant au spectre d'excitation/émission de fluorescence Cy3, avec une intensité de fluorescence enregistrée dans des unités arbitraires entre 0 et 65536. La conception du tableau a suivi la disposition des fonctionnalités 25:36 décrite dans la section protocole. L'analyse est affichée après une orientation appropriée du tableau, avec le coin supérieur gauche peuplé de la plus longue chaîne de caractéristiques fiduciales. Ici, les caractéristiques fiduciales contiennent la version ADN du 25mer et devraient, en principe, toujours donner un signal de fluorescence positif afin d'effectuer l'alignement de balayage et l'extraction des données. Le microarray hybride devrait apparaître uniformément lumineux, avec les bords de la zone de synthèse étant toutefois généralement plus lumineux que le centre (jusqu'à 50% plus lumineux). La grande quantité de séquences reproduites, réparties au hasard dans toute la zone, réduit l'impact des artefacts spatiaux. Ici, chaque séquence (ADN et ARN) a été synthétisée à 2 000 endroits aléatoires. Il y a généralement un faible bruit de fluorescence (arrière-plan), le 50 a.u., qui conduit à un rapport signal/bruit de l'ordre de 200:1 à 800:1 dans les essais d'hybridation. Après l'extraction des données, les intensités de fluorescence sont moyennes et tracées .

Il existe une variabilité significative des valeurs de fluorescence absolue entre les expériences. Ici, nous montrons les résultats de trois synthèses indépendantes utilisant les mêmes paramètres de fabrication et la même manipulation post-synthétique. L'ADN 25mer, lorsqu'il est hybridé à son brin d'ADN complémentaire étiqueté Cy3, donnera des signaux de fluorescence allant de 20 000 à 30 000, très rarement au-dessus ou en dessous. L'ARN 25mer, lorsqu'il est hybride au même complément d'ADN étiqueté Cy3, donnera des intensités de fluorescence sur les caractéristiques correspondantes allant de 15 000 à 20 000. Cependant, l'intensité de fluorescence des duplex ARN/ADN descendparfois occasionnellement en dessous de 8 000, lorsque les duplex CORRESPONDANTs d'ADN/ADN vont encore fluorer dans la gamme 20 000-30 000. Dans de tels cas, les résultats pour l'ARN peuvent être considérés comme sous-optimaux. Une défaillance de synthèse ou d'hybridation, que ce soit pour l'ADN ou l'ARN, sera immédiatement perceptible lors de la numérisation de l'absence évidente de fluorescence. Il existe de multiples possibilités pour la synthèse de l'ARN d'échouer ou de réussir partiellement et elles seront décrites dans la partie de discussion.

Déprotection, clivage et récupération de la bibliothèque
Selon la complexité et la densité de la bibliothèque, la forme et le contour du tableau synthétisé peuvent être vus sans grossissement mais sous un éclairage approprié (Figure 4), avec l'ADN encore sous forme protégée. Après la déprotection avec EDA/toluène, et avant l'ajout d'eau afin de recueillir la bibliothèque clivée, la zone de synthèse contenant les oligonucléotides maintenant déprotégés peut se démarquer comme une zone hydrophile, lorsque le reste de la glissière de verre apparaîtra recouvert d'une couche hydrophobe turbide. L'observation directe de la zone de synthèse dépend de la superficie totale utilisée pour synthétiser les oligonucléotides : une plus grande utilisation de la zone de synthèse correspondra à une plus grande possibilité de distinction claire entre les régions hydrophiles et hydrophobes à la surface. Inversement, les bibliothèques synthétisées à l'aide de moins de miroirs et avec des fonctionnalités plus petites peuvent ne pas être immédiatement observables.

De même, la quantité d'ADN récupéré après le dessalement est directement proportionnelle à la surface totale utilisée pour la synthèse. Si toutes les caractéristiques sont utilisées pour la synthèse de l'oligonucléotide, le clivage et la procédure de récupération devraient donner entre 25 et 30 pmol d'ADN. Une utilisation de 10% de la zone de synthèse ne permettra donc qu'environ 3 pmol d'ADN.

Figure 1
Figure 1 . Structures chimiques des phosphoramidites d'ADN et d'ARN utilisées dans la synthèse d'oligonucléotide par photolithographie de microarray. Les groupes de protection photosensibles standard nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) au 5'-OH sont utilisés dans la synthèse régulière de microarray d'ADN et d'ARN à des fins d'hybridation. Pour la synthèse des bibliothèques d'ADN complexes, plus le benzyl-NPPOC (BzNPPOC) est préféré au 5'-OH, car BzNPPOC est éliminé deux fois plus vite que nPPOC, ce qui réduit considérablement le temps total de synthèse des microréseaux. Les oligonucléotides d'ADN pour des bibliothèques exigent également le couplage d'un monomère de dT cleavable à l'extrémité de 3' Ce monomère, qui porte une fonction ester succinyl, sera clivé pendant la déprotection, permettant à l'ADN d'être prélevé à partir de la puce. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 . Exemple de masque comme fichier d'image envoyé à l'appareil micromiroir pendant l'exposition aux UV. Les pixels blancs correspondent à des miroirs qui seront inclinés dans la position «ON», reflétant la lumière UV sur la cellule de synthèse. Les pixels noirs correspondent aux miroirs "OFF", où la lumière UV sera réfléchie loin de la cellule. Les pixels blancs permettront donc l'accouplement de la phosphoramidite entrante suivante sur les oligonucléotides trouvés aux caractéristiques correspondantes sur les substrats de verre. Oligonucléotides synthétisés sur les entités dont les miroirs correspondants sont, dans ce fichier masque, les pixels noirs resteront cependant inertes lors du prochain événement de couplage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 . Photographies de la photolithographie microarray optique et la configurationde synthèse . (A) Circuit optique pour l'exposition aux UV. La lumière UV de l'UV-LED est d'abord homogénéisée par un tuyau de lumière rectangulaire-section, puis réfléchit sur les micromiroirs. Les micromiroirs qui ont été inclinés dans une position "OFF" refléteront la lumière UV loin de la cellule de synthèse, mais les micromiroirs dans la position "ON" refléteront la lumière sur la cellule de synthèse, située au plan focal, en passant d'abord par un relais 1:1 Offner système d'imagerie. (B) La cellule de synthèse, une fois assemblée, se compose d'une diapositive forée placée en premier sur le bloc de quartz de la cellule, séparée par un joint PTFE épais (non montré). Une deuxième glissière non forée est ensuite placée au-dessus de la glissière forée, séparée par un mince joint PTFE. Un cadre métallique (non montré) maintient l'assemblage ensemble. (C). Pour la préparation de la bibliothèque, une fois que la cellule de synthèse est fixée au plan focal de la lumière UV entrante, la chambre située entre le bloc de quartz et la glissière forée est remplie d'une solution de 1 % de carotène dans le CH2Cl2. Pour ce faire, un tube d'entrées et de sortie supplémentaire est fixé au bloc de quartz et la solution orange s'écoule de la position la plus à droite vers la position la plus à gauche. Le flux de réactifs et de solvants pour la synthèse est représenté en flèches blanches. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 . La zone de synthèse est généralement visible à l'œilnu. Ici, une bibliothèque d'ADN peut être vu sur la surface de verre juste après la synthèse, avec l'ADN encore sous forme protégée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 . Les analyses d'hybridation aux séquences d'ADN et d'ARN 25mer synthétisées in situ sur des microréseaux. (A) Balayage de fluorescence de l'ADN et du microarray hybrides entiers. 25mer L'ADN et les oligonucléotides d'ARN sont hybridés à leurs brins complémentaires Cy3-étiquetés. Le tableau a été scanné avec un laser à une longueur d'onde d'excitation de 532 nm, à une résolution de 5 m. (B) Intensités de fluorescence (unités arbitraires) de l'ADN : ADN et ARN : duplex d'ADN dans trois expériences séparées. Les données vert clair pour les oligonucléotides d'ARN synthétisés in situ peuvent être considérées comme sous-optimales, par rapport à l'intensité de fluorescence des séquences d'ADN correspondantes. Les barres d'erreur sont SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 . Représentation schématique de la procédure de déprotection, de clivage et de récupération pour les bibliothèques d'ADN synthétisées sur microréseaux. Les séquences d'ADN sont cultivées sur un nucléoside dT cleavable sensible à la base (indiqué dans la zone zoomée). Après synthèse, la déprotection des oligonucléotides d'ADN (les groupes de protection de base sont représentés comme des sphères rouges) dans edA/toluène laisse le matériau déprotégé électrostatiquement lié à la surface et peut ensuite être pipetted en appliquant une petite quantité de l'eau sur la zone synthétisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 . Spectre d'absorption représentatif (220 - 350 nm) d'une bibliothèque d'ADN clivée et dessalée contenant 4 000 séquences différentes, d'une longueur de 100.n. Un total de 940 ng d'ADN a été isolé à partir d'une synthèse de tableau unique, correspondant à 30 pmol du total d'ADN, ou 15 pmol par substrat en verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Table 1
Tableau 1. Protocole de cycle représentatif pour le couplage/oxydation/photodeprotection de 5'-BzNPPOC-dA, en supposant que la phosphoramidite correspondante a été chargée sur le port "A". Le temps d'accouplement (en secondes) est affiché à la ligne " couple monomère ". Le temps de photodeprotection UV, correspondant ici à une énergie radiante de 3 J/cm2 (photochimie BzNPPOC), est calculé comme le temps écoulé entre les deux signaux de communication "Event 2 Out".

Table 2
Tableau 2. Protocole de cycle représentatif pour le couplage/oxydation/photodeprotection de 5'-NPPOC-rA, en supposant que la phosphoramidite d'ARN correspondante a été chargée sur le port "A". Le temps d'accouplement (en secondes) est affiché à la ligne " couple monomère ". Le temps de photodeprotection UV, correspondant ici à une énergie radiante de 6 J/cm2 (photochimie NPPOC), est calculé comme le temps écoulé entre les deux signaux de communication "Event 2 Out".

Discussion

La synthèse de l'ADN et de l'ARN en phase solide est le pain et le beurre de chaque laboratoire de chimie de l'acide nucléique, et bien que l'ajout du composant de photolithographie soit certes une opération complexe, la fabrication de microarray médiée par la lumière UV est également un processus très fiable . C'est, en outre, la seule méthode disponible pour la synthèse in situ d'ARN sur des microarrays. Pourtant, comme dans toute procédure expérimentale en plusieurs étapes, il y a amplement de place pour l'erreur humaine.

Peut-être l'étape la plus critique est le couplage d'une phosphoramidite, car il doit être une réaction chimique constamment à haut rendement afin de se permettre des oligonucléotides avec peu d'erreurs synthétiques. Dans notre protocole de synthèse de microarray, le couplage de phosphoramidite est encore plus essentiel à la qualité globale de synthèse puisque le processus de fabrication contourne le plafonnement et empêche la purification d'oligonucléotide. Des gains d'efficacité de couplage stepwise supérieurs à 99 % ont été calculés pour tous les phosphoramidites d'ADN et d'ARN photosensibles, même pour des temps d'accouplement très courts (15 s)24, mais des rendements d'accouplement plus faibles peuvent parfois se produire, en particulier dans le cas des amidites dG. La stabilité des phosphoramidites solubilisés à température ambiante a été étudiée avant et a été montrée pour dépendre de la nature de la nucléobase, avec des phosphoramidites de guanosine sujettes à la dégradation étendue en seulement une question de jours29, 30. Mais lorsqu'ils sont stockés à -25 oC, les phosphoramidites d'ACN dissous acdissés de 30 mM se sont avérées stables pendant plusieurs semaines. L'instabilité relative des solutions de phosphoramidite dG à température ambiante signifie cependant qu'elles ne doivent pas être maintenues attachées au synthétiseur d'ADN pendant plusieurs jours.

Pour les phosphoramidites à ARN, le rendement du couplage dépend beaucoup de la qualité de la phosphoramidite (qui peut être évaluée par spectroscopie 31 P NMR) et du temps d'accouplement. Les temps d'accouplement de 5 minutes pour rA, rG, rC et 2 min pour le rU semblent nécessaires. En effet, nous avons constaté que le raccourcissement du temps de condensation à 2 min pour tous les phosphoramidites d'ARN a mené aux signaux d'hybridation sensiblement inférieurs.

Le synthétiseur d'ADN lui-même, ainsi que les réactifs et les solvants, doit certainement être aussi propre que possible afin d'atteindre le rendement le plus élevé de la synthèse de l'oligonucléotide. Cependant, les matières insolubles, les sels ou les particules, peuvent s'accumuler au fil du temps dans les lignes et les tubes du système de livraison, conduisant à une diminution progressive de la consommation de réactifs et de réactifs. Lorsqu'un nettoyage général du synthétiseur ne résout pas un faible volume de sortie, une augmentation du nombre d'impulsions peut être une solution alternative. Particulièrement utile dans le cas d'une faible consommation de phosphoramidite, la ligne du protocole d'accouplement correspondant au pompage d'un mélange de phosphoramidite et d'activateur (troisième ligne de la sous-section de couplage du tableau 1 et du tableau 2) peut être modifié, de 6 à 9 impulsions sans aucun effet négatif appréciable sur la qualité de synthèse. De plus, le nombre d'impulsions de l'activateur nécessaire pour amener le mélange amidite/activateur au substrat de synthèse (actuellement 6, quatrième ligne dans la sous-section d'accouplement, voir tableau 1 et tableau 2) dépend du synthétiseur d'ADN lui-même ainsi que du longueur de tuyauterie dans la cellule de synthèse. Ce nombre peut être ajusté après avoir remplacé la phosphoramidite par une solution colorée et compte le nombre d'impulsions nécessaires pour pousser le mélange coloré vers le substrat de verre pour le couplage.

La méthode décrite ci-dessus permet à la synthèse de l'ADN et de l'ARN de se faire simultanément, sur le même microréseau. Les hybrides d'ADN et d'ARN peuvent également être préparés sans aucun changement aux protocoles de fabrication du tableau, et tant que le protocole de déprotection en trois étapes est suivi. Cependant, il convient de noter que les microréseaux à ARN seulement ne nécessitent qu'une déprotection en deux étapes : une décyanoéthylation d'abord avec et3N suivie de l'hydroxyle et de la déprotection de base avec l'hydrazine. Les nucléobases d'ADN se sont avérées incomplètement déprotégées dans ces conditions, et ont besoin de l'étape supplémentaire dans EDA afin d'effectuer l'enlèvement complet des groupes de phénoxyacetyl (Pac). Ce traitement supplémentaire avec EDA est plus court (5 min) que pour la déprotection standard des microréseaux d'ADN31,mais il suffit de le conduire à l'achèvement après les traitements de triéthylamine et d'hydrazine. En outre, un court temps de réaction avec EDA limite l'exposition d'un oligonucléotide d'ARN entièrement déprotégé aux conditions de base.

Un avantage de la synthèse in situ de tableau d'ARN au-dessus des méthodes alternatives comme la repérage ou la transcription d'ADN32,33,34 est la capacité de stocker la puce synthétisée d'ARN sous forme protégée jusqu'à l'utilisation, évitant ainsi le risque de dégradation potentielle de l'ARN. Les procédures post-synthétiques pour l'ARN impliquent, d'autre part, que les consommables et les réactifs sont maintenus stériles et que la manipulation est effectuée dans des conditions sans RNase. Il convient de noter que nous avons constaté que l'ajout d'inhibiteur de la RNase au mélange d'hybridation n'a pas donné lieu à des signaux d'hybridation plus forts pour les caractéristiques de l'ARN.

La synthèse des bibliothèques d'ADN sur un monomère sensible à la base est plus complexe que la synthèse de quelques séquences de contrôle sur une surface, et en tant que telle est certainement plus sujette aux erreurs de conception. Pourtant, en supposant que la conception de la séquence (c'est-à-dire la nature et le nombre de séquences) est correcte, la transformation de cette liste en une collection de masques d'exposition et une série ordonnée de cycles d'accouplement reste un processus simple. Cependant, d'importantes variations de la synthèse standard des microréseaux existent et sont essentielles à la fabrication réussie d'un réseau de bibliothèques à haute densité.

Tout d'abord, un monomère dT sensible à la base est couplé comme le premier phosphoramidite après la synthèse du linker. Le rendement de couplage de ce monomère (figure 1) s'est avéré relativement faible, autour de 85 %28, c'est pourquoi des efforts sont faits pour améliorer son taux d'incorporation, soit en augmentant sa concentration en ACN de 30 mM à 50 mM, soit en répétant le Étape de couplage : deux réactions consécutives de couplage utilisant des monomères frais, ou deux cycles d'accouplement distincts mais consécutifs.

Le deuxième changement est l'ajout d'une solution de carotène dans la chambre arrière de la cellule de synthèse, qui absorbe commodément 365 nm de lumière. Il s'agit d'une modification importante de la configuration de la photolithographie car elle empêche la lumière UV de se refléter sur le substrat du tableau. En effet, après avoir traversé le milieu interstitiel entre les substrats, la lumière UV entrante sort par la glissière forée et atteint le bloc de quartz de la cellule. Les équations de Fresnel prédisent que 4 % de la lumière UV par incident perpendiculaire se reflétera à partir de chacune des trois interfaces air-verre en aval (côté de sortie du substrat 2nd et des deux côtés du bloc de quartz) et de retour sur le substrat de synthèse, l'exposition involontaire d'oligonucléotides photoprotégés. La diffraction et la dispersion contribuent également à la protection photodéprotection « hors cible » et, par conséquent, à l'insertion de nucléotides, ce qui affecte directement le taux d'erreur de synthèse, mais ces contributions sont beaucoup plus petites que les réflexions et peuvent être réduire la densité de synthèse (laissant des écarts entre les entités). Nous avons constaté que le niveau de la solution de carotène dans la chambre inférieure de la cellule tend à diminuer légèrement seulement pendant les premières minutes de synthèse de tableau, et doit donc être surveillé et réajusté.

Enfin, le troisième changement est la solution de déprotection, remplaçant EtOH par toluène, qui maintient la bibliothèque d'ADN clivé lié à la surface, sans doute par des interactions électrostatiques. L'application d'une petite quantité d'eau à la zone de synthèse après le lavage ACN permet de recueillir la bibliothèque facilement. Le processus n'est cependant couronné de succès que si la teneur en eau en EDA et en toluène est minime, rendant l'acide nucléique entièrement insoluble dans le cocktail de déprotection. Alternativement, les bibliothèques d'ADN peuvent êtreclivées outre de la puce utilisant l'ammoniac 9,10,14,35,puis davantage déprotégée en chauffant la solution d'ammoniac aqueuse contenant de l'ADN à 55 oC pendant la nuit. La récupération des bibliothèques d'ADN utilisant l'ammoniac n'est cependant pas compatible avec l'ARN. Les oligonucléotides d'ARN sur un substrat de base-cléavable peuvent être élifiés de la surface utilisant la même procédure edA/toluène décrite ci-dessus, mais seulement à l'avant-dernière étape après la stratégie de déprotectionendeux étapes et à l'hydrazine28.

D'autres stratégies pour récupérer les bassins d'oligonucléotides dans les microréseaux sans avoir besoin d'un traitement de base spécifique existent, sont en principe compatibles avec la photolithographie et reposent sur l'utilisation d'enzymes. Par exemple, un seul nucléotide deoxyuracil peut être la cible de la glycosylase uracil-ADN (UDG) et excisée du reste de la séquence d'ADN, ou une seule unité d'ARN peut être identifiée par les enzymes rnase H de type 2 et le lien phosphodiester 5' à l'ARN clivé , la libération de la partie 5' ADN23.

Nous avons maintenant une méthode puissante, fiable et à haute densité pour la synthèse de l'ADN, de l'ARN et des microréseaux hybrides d'ADN/ARN. Ceux-ci peuvent non seulement servir de plates-formes pour l'hybridation ou les essais de liaison36, mais ils représentent également un moyen rapide et peu coûteux de produire des bibliothèques complexes d'acide nucléique. Pour le stockage de données numériques à base d'ADN, la microlithographie peut devenir une solution potentielle au goulot d'étranglement de l'écriture (c.-à-d. au codage de l'information par synthèse). Le succès de l'encodage numérique sur l'ADN et dans l'assemblage des gènes de novo dépend de la fidélité de la séquence qui, au niveau de la synthèse, se traduit par le taux d'erreur. Les erreurs synthétiques et optiques dans nos protocoles actuels de fabrication de tableau seront discutées et rapportées ailleurs. Parallèlement, des efforts sont en cours pour accroître encore l'échelle de fabrication et le débit.

Disclosures

Les auteurs certifient qu'ils n'ont aucune affiliation avec un organisme à but lucratif.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par le Fonds autrichien pour la science (subventions FWF P23797, P27275 et P30596) et la Fondation nationale suisse pour la science (Grant #PBBEP2_146174).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slide functionalization
Acetic acid >99.8% Sigma 33209 For RNA deprotection
CNC router Stepcraft 300 CK
Ethanol absolute VWR 1.07017.2511 For deprotection and functionalization
N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide Gelest SIT8189.5 Silanizing reagent
Nexterion Glass D microscope slides Schott 1095568
Polymax 1040 Heidolph Orbital shaker
Proclean 507 Ultrasonic water bath Ulsonix To clean slides after drilling
Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner Sigma Z860086 To clean slides after drilling
Microarray synthesis
0.25 M dicyanoimidazole in ACN Biosolve 0004712402BS Activator
0.7 XGA DMD Texas Instruments Digital Micromirror Device
20 mM I2 in pyridine/H2O/THF Sigma L860020-06 Oxidizer
250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer FFKM Lower teflon gasket
2'-O-ALE RNA phosphoramidites ChemGenes
365 nm high-power UV-LED Nichia NVSU333A
5'BzNPPOC DNA phosphoramidites Orgentis
5'NPPOC DNA phosphoramidites FlexGen
Acetonitrile Biosolve 0001205402BS For DNA synthesis
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma L010010 For dissolving phosphoramidites
Cleavable dT ChemGenes Base-sensitive monomer for library preparation
DMSO Biosolve 0004474701BS As exposure solvent
DNA and RNA microarray deprotection
Ethylenediamine >99.5% Sigma 3550 For deprotection
Expedite 8909 PerSeptive Biosystems DNA synthesizer
Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine Sigma 225819 For RNA deprotection
Imidazole Sigma 56750
Industrial Strength lower-density PTFE tape Gasoila Thin, upper teflon gasket
Pyridine >99% Sigma P57506 For RNA deprotection
Triethylamine >99% Sigma T0886 For RNA deprotection
β-carotene Sigma C9750 For library preparation
Hybridization and scanning
20x Sodium Saline Citrate Roth 1054.1
5'Cy3-labelled complementary strand Eurogentec For duplex hybridization
Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube Eppendorf
BSA (10 mg/mL) Promega R3961
EDTA molecular biology grade Promega H5031
GenePix 4100A Molecular Devices Microarray scanner
Hybridization oven Boekel Scientific 230500
MES monohydrate Sigma 69889
MES sodium Sigma M3058
NaCl >99.5% Sigma 71376
SecureSeal SA200 hybridization chamber Grace BioLabs 623503
Spectrafuge mini Labnet C1301 Microarray centrifuge
Tween-20 molecular biology grade Sigma P9416
Data extraction
Excel Microsoft For data extraction
MatLab MathWorks Microarray design
NimbleScan 2.1 Roche NimbleGen
Desalting and quantification
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Scientific
Toluene Merck
ZipTip C18 Millipore ZTC18s008 Desalting pipet tips

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Microréseaux d'ADN et d'ARN à haute densité - Synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques d'acide nucléique
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Lietard, J., Schaudy, E., Hölz, K., Ameur, D., Somoza, M. M. High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries. J. Vis. Exp. (150), e59936, doi:10.3791/59936 (2019).

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