Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

Summary

Aquí, describimos un protocolo para introducir un knockout genético en el amastigote extracelular de Trypanosoma cruzi, utilizando el sistema CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento puede ser seguido ya sea por el recuento celular de la cultura axenic amastigote o por la proliferación de amastigotes intracelulares después de la invasión de la célula huésped.

Abstract

El trypanosoma cruzi es un parásito protozoario patógeno que causa la enfermedad de Chagas principalmente en América Latina. Con el fin de identificar un nuevo objetivo farmacológico contra T. cruzi, es importante validar la esencialidad del gen diana en la etapa de mamíferos del parásito, el amastigote. Amastigotes de T. cruzi se replican dentro de la célula anfitriona; por lo tanto, es difícil llevar a cabo un experimento eliminatorio sin pasar por otras etapas del desarrollo. Recientemente, nuestro grupo informó de una condición de crecimiento en la que el amastigote puede replicar axenéticamente hasta 10 días sin perder sus propiedades similares a amastigote. Mediante el uso de este cultivo axenic amastigote temporal, introdujimos con éxito gRNAs directamente en el amastigote expreso de Cas9 para causar nocauts genéticos y analizar sus fenotipos exclusivamente en la etapa de amastigote. En este informe, describimos un protocolo detallado para producir acomodatigotes extracelulares derivados in vitro, y para utilizar el cultivo axenético en un experimento de nocaut mediado por CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento de los amastigotes knockout puede ser evaluado ya sea por recuento saldeo celular del cultivo axenico, o por la replicación del amastigote intracelular después de la invasión de la célula huésped. Este método evita la diferenciación de la etapa del parásito normalmente implicada en la producción de un atigote transgénico o de nocaut. La utilización de la cultura axenic amastigote temporal tiene el potencial de ampliar la libertad experimental de estudios específicos de etapa en T. cruzi.

Introduction

El trypanosoma cruzi es el agente causante de la enfermedad de Chagas, que es frecuente principalmente en América Latina¹. T. cruzi tiene etapas distintivas del ciclo de vida,ya que viaja entre un vector de insectos y un huésped de mamíferos 2. T. cruzi se replica como un epimastigote en el intestino medio de un insecto triatomina chupa sangre y se diferencia en un trippomastigono metacíclico infeccioso en su intestino posterior antes de ser depositado en un huésped humano o animal. Una vez que el trippomastigoto entra en el cuerpo del huésped a través del sitio de la picadura o a través de una....

Protocol

NOTA: En la Figura 1se muestra una descripción general de todo el flujo experimental.

Figura 1: Descripción general del experimento knockout con EA. Los trippomastigotes derivados del cultivo de tejidos se cosechan y se diferencian en EA. gRNA se transfectó en acomodatos expresos cas9 por electroporación, y el fenotipo de crecimiento del amastigote de nocaut se evalúa ya sea por replicación axenica o por replicación axenica o p....

Results

Aislamiento de los trippomastigotes por el procedimiento de piscina

Para cosechar trippomastigotes frescos de eAs viejos contaminantes por procedimiento de natación, los pellets celulares necesitan ser incubados al menos durante 1 h. Incubar los pellets durante más de 2 h no aumenta significativamente el número de trippomastitos que nadan en la solución ( Figura 2B). En este experimento en particular, el porcentaje de trippomastigote en la mezcla .......

Discussion

Demostramos que el cultivo axenico de Los amastigotes de T. cruzi se puede utilizar en el knockout de genes mediado por CRISPR/Cas9, electroportando el ARNM en forma directa en el EA que expresa Cas9. De esta manera, la esencialidad del gen objetivo específicamente en la etapa de amastigote puede ser evaluada sin pasar por otras etapas del desarrollo.

Otro aspecto beneficioso de la transfección de amastigote es la conveniencia en las pruebas para un gran número de genes diana. Una vez.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de formalina al 20%	FUJIFILM Wako Pure Chemical	068-03863	celdas de fijación
25 cm2 matraz de cultivo con tapón de doble sellado	AGC Techno Glass	3100-025
75 cm2 matraz de cultivo con tapón de doble sellado	AGC Techno Glass	3110-075
Microscopio de fluorescencia todo en uno	Keyence	BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (para control)	IDT		secuencia diana personalizada = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (para TcCGM1)	IDT		secuencia diana personalizada = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (para TcPAR1)	IDT		secuencia diana personalizada = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072532	para recocer con crRNA
Amaxa Dispositivo nucleofactor	LONZA	AAN-1001	electroporación
Kit Básico de Nucleoinfección de Parásitos 2	LONZA	VMI-1021	electroporación
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	componente del medio para amastigogénesis in vitro
Burker-Turk hemocitómetro desechable	Watson	177-212C	recuento de células
Coster de 12 pocillos transparentes con tratamiento TC placas de pocillos	múltiples Corning	3513
DMEM	FUJIFILM Wako Pure Chemical	044-29765	medio de cultivo
Suero fetal bovino, Defined	Hyclone	SH30070.03	inactivar el calor antes
de usar G-418 Solución de sulfato	FUJIFILM Wako Pure Chemical	077-06433	selección de cloruro
de hemin transformante	Sigma-Aldrich	H-5533	componente del medio LIT
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	tinción de núcleos
Caldo de infusión de hígado, Difco	Becton Dickinson	226920	componente del medio LIT
MES	FUJIFILM Wako Pure Chemical	349-01623	componente del medio para amastigogénesis in vitro
PBS (–)	FUJIFILM Wako Pure Chemical	166-23555
Yoduro de propidio	Sigma-Aldrich	P4864-10ML	tinción de células muertas
RPMI 1646	Sigma-Aldrich	R8758	medio para metaciclogénesis