Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Shobana Sekar; Philipp Geiger; Lori Cuyugan; Annalee Boyle; Geidy Serrano; Thomas G. Beach; Winnie S. Liang

doi:10.3791/59981

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Methodenartikel

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

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DOI:

10.3791/59981

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14. November 2019

Shobana Sekar¹^,² , Philipp Geiger¹^,² , Lori Cuyugan¹^,² , Annalee Boyle¹^,² , Geidy Serrano²^,³ , Thomas G. Beach²^,³ , Winnie S. Liang¹^,²

¹Translational Genomic Research Institute, ²Arizona Alzheimer's Consortium, ³Banner Sun Health Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.

Zusammenfassung

Circular RNAs (circRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs, die an Funktionen wie Mikro-RNA-Regulierung (miRNA), Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt sind. In der klassischen RNA-Sequenzierung der nächsten Generation (RNA-seq) werden CircRNAs in der Regel als Ergebnis der Poly-A-Auswahl während des Aufbaus von mRNA-Bibliotheken übersehen oder sind in sehr geringer Häufigkeit zu finden und daher schwer zu isolieren und zu erkennen. Hier wurde ein circRNA-Bibliotheksbauprotokoll optimiert, indem Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und verschiedene gesamte RNA-Eingangsmengen verglichen wurden. Getestet wurden zwei handelsübliche Volltranskriptom-Bibliotheksvorbereitungskits mit und ohne RNase R-Vorbehandlung und unter Verwendung variabler Mengen des gesamten RNA-Eingangs (1 bis 4 g). Schließlich, mehrere Gewebetypen; einschließlich Leber, Lunge, Lymphknoten und Bauchspeicheldrüse; sowie mehrere Hirnregionen; einschließlich des Kleinhirns, des minderwertigen parietalen Lappens, des mittleren zeitlichen Gyrus, des okzipitalen Kortex und des überlegenen frontalen Gyrus; wurden verglichen, um die Häufigkeit von ZirkRNA über Gewebetypen hinweg zu bewerten. Die Analyse der generierten RNA-Seq-Daten mit sechs verschiedenen circRNA-Detektionswerkzeugen (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC und CIRCexplorer) ergab, dass ein gestrandetes Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitungskit mit RNase R-Vorbehandlung und 4-g-RNA-Eingang der optimale Methode zur Identifizierung der höchsten relativen Anzahl von circRNAs. Im Einklang mit früheren Befunden wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs in Hirngeweben im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.

Einleitung

Circular RNAs (CircRNAs) sind endogene, nicht-kodierende RNAs, die aufgrund ihrer allgegenwärtigen Expression im eukaryotischen Transkriptom¹^,²^,³Aufmerksamkeit erlangt haben. Sie werden gebildet, wenn exons zurück zueinander und daher wurden zunächst als spleißende Artefakte⁴^,⁵. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass CircRNAs Zelltyp, Gewebe und Entwicklungsstadium spezifische Expression³^,⁶ aufweisen und evolutionär konserviert sind²....