معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولات معالجة مفصلة لتصوير عينات الأنسجة الحساسة باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني (SEM). وهناك ثلاث طرق معالجة مختلفة، وهي التجفيف الكيميائي لسداسي ميثيل ديسيلازانا (HMDS)، وتجفيف الهواء البسيط، وتجفيف النقاط الحرجة، ووصفها لإعداد قشر البيض الصلب، والأجنة في مراحل النمو المبكرة، والثقافات الفطرية على التوالي.

الملخص

وعلى الرغم من أن الفحص المجهري للإلكترون (SEM) يستخدم على نطاق واسع لإجراء تحليل هيكلي فائق لمختلف العينات البيولوجية وغير البيولوجية، فإن الأساليب التي تنطوي عليها معالجة العينات البيولوجية المختلفة تنطوي على ممارسات فريدة من نوعها. جميع الممارسات التقليدية الموصوفة في المؤلفات لمعالجة العينات لا تزال تجد تطبيقات مفيدة، ولكن التغييرات الدقيقة في إعداد العينة يمكن أن تغير جودة الصورة، وكذلك، إدخال القطع الأثرية. وبالتالي، فإن استخدام تقنية إعداد عينة فريدة من نوعها محددة لنوع الأنسجة التي تم تحليلها مطلوب للحصول على صورة ذات نوعية جيدة مع دقة فائقة الهيكلية. تركز هذه الدراسة على توفير بروتوكولات إعداد العينات المثلى لتصوير الأجنة، والأصداف البيض الصلبة، والثقافات الفطرية باستخدام SEM. وقد أوصي تُوصِّل التحسينات التالية لتحقيق نتائج جيدة للعينات البيولوجية الحساسة الثلاث المختلفة التي تمت دراستها. استخدام المثبتات أكثر اعتدالا مثل 4٪ بارافورمالدهايد أو 3٪ الجلوتالالديهايد تليها الجفاف مع سلسلة الإيثانول إلزامي. الميسليوم الفطري على كتل أجار التي تم الحصول عليها من قبل الثقافات الشريحة تسفر عن سلامة أفضل فائقة الهيكلية بالمقارنة مع الثقافات التي اتخذت مباشرة من لوحات أجار. التجفيف الكيميائي للأجنة مع HMDS يوفر التجفيف دون إدخال القطع الأثرية التوتر السطحي مقارنة مع التجفيف نقطة حرجة. HMDS يمنع تكسير الناجمة عن انكماش كما عينات أقل هشاشة أثناء التجفيف. ومع ذلك، للثقافة الفطرية، التجفيف نقطة حرجة يوفر جودة صورة مقبولة بالمقارنة مع التجفيف الكيميائي. يمكن تصوير قشر البيض مع عدم وجود خطوات إعداد خاصة باستثناء الغسيل الدقيق وتجفيف الهواء قبل التركيب. وتم توحيد منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة المقبولة التي تم الحصول عليها مع كل تجربة.

المقدمة

المسح المجهر الإلكتروني (SEM) التحليل الهيكلي الفائق والتصوير داخل الخلايا تكملة المجهرية الخفيفة لتوصيف ثلاثي الأبعاد من prokaryotes والنباتات والحيوانات. الاستبانة المكانية العالية لSEM يجعلها واحدة من أكثر التقنيات تنوعا وقوة المتاحة لفحص الخصائص الميكروالهيكلية للعينات في مقياس نانومتر إلى مقياس ميكرومتر. يتم حل العينات المجففة إلى الهياكل التركيبية والطوبوغرافية مع التفاصيل المكثفة، والتيتوفر الأساس لوضع استنتاجات صحيحة حول العلاقات الوظيفية 1،^{2،3 , 4 , 5 , 6 ,}

البروتوكول

ملاحظة: تم جمع السلاحف المطلية(Chrysemys picta)البيض المستخدمة في هذه الدراسة خلال موسم التعشيش من مايو حتى يونيو 2015-16 من محطة رايس كريك الميدانية، أوغويغو نيويورك بإذن تم الحصول عليها من وزارة البيئة في ولاية نيويورك الحفظ (DEC).

1. طريقة التجفيف الكيميائي لمعالجة الأجنة لSEM

1. جمع بيض السلاحف من المواقع الميدانية خلال موسم التعشيش. إعداد غرف الحضانة مقدما، مصنوعة من صناديق بلاستيكية مع أغطية (L × W × H) 6.7 سم × 25.4 سم × 10.2 سم مليئة الفراش المتوسطة أعدت مع خليط رطب من الفيرميكوليت والخث الطحلب (1:1 نسبة). جعل 4-6 ثقوب من حوالي 0.25 سم على طول جانبي الصناديق وعلى الغطاء للسماح بـ aeration.
2. إزالة التربة بلطف....

النتائج

ويبين الشكل 1 التحليل المجهري للإلكترون للسلحفاة المطلية (Chrysemyspicta) الأجنة. تم استخدام بيض السلاحف المطلية التي تم جمعها واحتضانها على وسط الفراش، التي شنت على كعب الألومنيوم بعد التجفيف الكيميائي لتصوير SEM (الشكل1A-E). تظهر الرؤية الجانبية للجنين في المرحلة 12 هياكل الوجه القحفي. تمتد البروز الفكية إلى ما وراء الفك السفلي وتحد من حفرة أنفية ملحوظة بشكل جيد. كما لوحظت خمسة أقواس البلعوم (الشكل1

المناقشة

في دراستنا، تم اختبار عوامل التثبيت المختلفة، وطرق الجفاف والتجفيف لإعداد ثلاث عينات بيولوجية حساسة مختلفة لتصوير SEM: الأجنة، قشر البيض، والثقافات الفطرية. يستخدم SEM عادة لتحليل السطح، لذلك الاختراق المثبت هو أقل فيما يتعلق، ولكن يجب أن يكون مفهوما أن الهياكل الداخلية الثابتة سيئة سوف يسبب تقلص الداخل و / و/وانهيارات الهياكل السطحية. وينبغي أيضا النظر في تمديد وقت التثبيت لعينات الأنسجة أكبر، واستبدال الحل المثبت عدة مرات اعتمادا على مدة التثبيت. بسبب التفاعل النشط بين المثبت والأنسجة ، فإن الخصائص التناضحية للخلايا تت.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أجار	فيشر S25127A علمي		لمزارع الشرائح
كعب دبوس الألومنيوم	Tedpella	16111	12.7 مم × 8 مم
BD Difco وسائط الثقافة المجففة: سكر العنب البطاطا أجار	BD 213400	DF0013-17-6	وسائط لعزل وزراعة الفطريات والخميرة والعفن
الكواشف الحيوية Chloramphenicol	Fischer	BP904-100	مضاد حيوي للوسائط
الخشنة الفيرميكوليت	الدفيئة Megastore	SO-VER-12	الفراش متوسط
واضح 12- لوحة بئر	Corning	07-201-589	لتثبيت الأجنة
Coverslips	Fischer Scientific		S17525B لثقافة الشرائح
مجفف النقطة الحرجة	Quorum CPD	EMS850	النقطة الحرجة
أطباق ثقافة	Fischer Scientific	08 747B	طبق بتري 100 × 10 مم 12 / PK
الإيثانول	فيشر العلمي	A406P 4	عامل الجفاف
الملقط- ملاقط الدلو	Tedpella	5804	نمط 4 ، الطول 108 مم ، الوزن × سمك 0.017 × 0.17 مم
الجلوتارالديهايد	فيشر Scientific	G151-1	مثبت
الهدف الذهبي لطلاء الرش	DENTON VACUUM	TAR001-0158	الهدف الذهبي ، 2.375 &Prime. D X .002 & Prime ؛
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	عامل التجفيف الكيميائي
مناديل كيم المبللة	Kimtech	S-8115	تنظيف
شرائح المجهر	Thermo Scientific	67-762-16	لمقص الفحص المجهري لثقافة الشرائح
	Tedpella	1327	مزدوج المدبب ، الفولاذ المقاوم للصدأ ، 100 مم L (3-5 / 8 بوصة).
مقص دقيق	Tedpella	1346	نوع Vannas ، مستقيم ، 80 مم L
Moria مثقب الجنين ملعقة	أدوات العلوم	الدقيقة 10370-17	الطول 14.5 سم ، قطر الطرف 20 مم ، عمق الملعقة 5 مم
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 مم إدراج مع 74 & micro ؛ م غشاء بوليستر بحجم شبكة يعمل كناقلات يدوية أثناء معالجة العينات في مذيبات مختلفة
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	مثبت
الخث الطحالب	وول مارت- معجزة Gro	551705263	الفراش متوسط
علامات تبويب PELCO شريط موصل كربوني مزدوج	العصا Tedpella	5000	12 مم OD
Sputter المغطي	DENTON VACUUM	DESK V	طلاء معدني رقيق
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV مسح إلكتروني نطاق	المجهر الإلكتروني

تجفيف