Method Article

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

DOI:

10.3791/60043

⸱

September 25th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu küresel bir sağlık sorunudur. Dünya çapında etkilenen 350 milyondan fazla kişi ile, HBV enfeksiyonu karaciğer kanserinin önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Bu, özellikle gelişmekte olan ülkelerde önemli bir sorundur. Bağışıklık sisteminin HBV'ye karşı etkili bir yanıt vermemesi kronik enfeksiyona yol açar. HBV aşısı mevcut ve yeni antiviral ilaçlar oluşturulmaktadır rağmen, virüs-rezervuar hücrelerinin eradikasyonu önemli bir sağlık konusu olmaya devam etmektedir. Burada açıklanan viral antijen üretimi için bir yöntemdir (Ag) -spesifik CD8+ sitotoksik T lenfositler (CTLs) indüklenen pluripotent kök hücrelerden türetilen (iPSCs) (yani, iPSC-CTLs), HBV replikasyonbastırmak için yeteneğine sahip. HBV replikasyonu farelerde hbv ekspresyonu plazmidi pAAV/HBV1.2'nin karaciğere hidrodinamik enjeksiyonu ile etkin bir şekilde indüklenir. Daha sonra, HBV yüzey Ag-spesifik fare iPSC-CTLs büyük ölçüde karaciğer ve kanda HBV replikasyon bastırır ve hepatositlerde HBV yüzey Ag ekspresyonunu önler, benimsenden aktarılır. Bu yöntem, hidrodinamik enjeksiyon sonrası farelerde HBV replikasyonu gösterir ve kök hücre kaynaklı viral Ag-spesifik CTLs HBV replikasyonbastırmak olabilir. Bu protokol HBV immünoterapi için yararlı bir yöntem sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut enfeksiyon dan sonra, adaptif bağışıklık sistemi (yani, humoral ve hücresel bağışıklık) akut HBV ile ilgili hepatit toplu kontrol eder. Yine de, HBV-endemik bölgelerde insanların bir dizi virüsleri ortadan kaldırmak ve daha sonra kronik bireyler olarak dönüştürmek olamaz. Kronik hastaların %25'inden fazlası (>250 milyon kişi) dünya çapında ilerleyici karaciğer hastalığı gelişir ve karaciğer sirozu ve/veya hepatosellüler karsinom (HCC)1. Sonuç olarak, ısrarla enfekte hücrelerin eradikasyonu genel bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir, mevcut bir aşı olmasına rağmen2 ve çok sayıda antiviral ilaçlar geliştirilmekte....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri Texas A&M Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (IACUC; #2018-0006) tarafından onaylanır ve Laboratuvar Hayvan Bakımı Nın Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmektedir. Fareler 6-9 yaş ları arasında kullanılır.

1. IPSC'lerden viral Ag'ye özgü CD8+ T hücrelerinin (iPSC-CD8+ T hücreleri) üretimi

  1. Retroviral yapılar oluşturulması
    NOT: TCR α ve β genleri 2A kendi kendine ayrılma sırası ile bağlantılıdır. Retroviral vektör MSCV-IRES-DsRed (MiDR) DsRed+ 23olduğunu .
    1. Alt klon HBs183-191 (FLLTRILTI)-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada gösterildiği gibi, HBV viral Ag-spesifik iPSC-CD8+ T hücreleri in vitro kültür sistemi tarafından oluşturulur. Bu viral Ag-spesifik iPSC-CD8+ T hücrelerinin ACT sonra önemli ölçüde bir murine modelinde HBV replikasyon bastırmak(Ek Dosya 1). Fare iPSC bir insan-fare hibrid HBV TCR geni kodlama MIDR retroviral yapı ile transdükmen edilir (HBs183-191-spesifik, s183), sonra gen-transdükse iPSC'ler notch ligands (hem DL1 ve DL4) ifade OP9-DL1/DL4 hücreleri ile eş kültür.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bir murine modelinde HBV replikasyonlarını bastırmak için ACT olarak kullanılmak üzere viral Ag-spesifik iPSC-CTLs oluşturmak için bir yöntem sunar. Kronik HBV enfeksiyonunda viral genom kararlı bir mini kromozom oluşturur, hepatositin ömrü boyunca devam edebilen kovalent kapalı dairesel DNA (cccDNA). Viral mini kromozomun temizlenmesinin hedeflanması kronik HBV enfeksiyonunun tedavisine neden olabilir. Mevcut antiviral tedavi virüsün ters transkriptazını hedefler ancak nadiren cccDNA tarafından yönlendirile.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) için cDNA sağlamak için Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü'nden Dr Adam J Gehring teşekkür- özel A2-sınırlı insan-murine hibrid TCR genleri, ve Dr Pei-Jer Chen Ulusal Tayvan Üniversitesi sağlamak için pAAV/HBV 1.2 yapısı. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü Hibe R01AI121180, R01CA221867 ve R21AI109239 J. S tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HHD farelerInstitut Pasteur, Paris, FransaH-2 sınıf I nakavt, HLA-A2.1-transgenik (HHD) fareler
iPS-MEF-Ng-20D-17RIKEN Hücre BankasıAPS0001
SNL76/7ATCCSCRC-1049
OP9ATCCCRL-2749
pAAV/HBV1.2 plazmidDr. Dr. Pei-Jer Chen (Tayvan Ulusal Üniversite Hastanesi, Tayvan)HBV DNA yapısı
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-spesifik TCR genleriDr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Kanada)FLLTRILTI-spesifik A2-kısıtlı insan-murin hibrid TCR genleri (Vα 34 ve Vβ 28)
OVA257– 264 spesifik TCR genleriDr. Dario A. Vignali (Pittsburgh Üniversitesi, PA)SIINFEKL'e özgü H-2Kb kısıtlı TCR genleri
Anti-CD3 (17A2) antikoruBiyoefsane100236
Anti-CD44 (IM7) antikoruBD Pharmingen103012
Anti-CD8 (53-6.7)antikoru Biyoefsane
Anti-IFN-&gama; (XMG1.2) antikoruBiolegend505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) antikoruBiolegend506306
α-MEMInvitrogenA10490-01
Anti-HBs antikoruThermo FisherMA5-13059
ACK Lizis tamponuLonza10-548E
Brefeldin ASigmaB7651
DMEMİnvitrojenABCD1234
FBSHycloneSH3007.01
FACSAria Füzyon hücre sıralayıcıBD656700
JelatinMilliporeSigmaG9391
GeneJammerAgilent204130
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamerProimmünF027-4A - 27
HRP Anti-Fare İkincilAntikor İnvitrojenA27025
mFlt-3LPeprotech250-31L
mIL-7Peprotech217-17
Nükleaz S7Roche10107921001
ParaformaldehitMilliporeSigmaP6148-500GDikkat: Alerjenik, Kanserojen, Toksik
Geçirgenleştirme tamponuBiolegend421002
PolybreneMilliporeSigma107689
ProLong™ DAPIInvitrogenP36931
QIAamp MinElute Virüs Spin KitiQiagen57704
Anti-CD4 (GK1.5) antikoru Biyoefsane 100408 100732 ile Altın Antifade Mountant

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
  2. Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stem Cell Derived T CellsViral Antigen Specific T LymphocytesHBV Replication SuppressioniPSC Derived CD8 Positive T CellsHydrodynamic HBV Plasmid DeliveryFlow Cytometric AnalysisImmunofluorescent LabelingAdoptive Cell TransferT Cell Receptor TransductionInterferon Gamma Production

Related Articles