异源物质外排泵在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中具有高度活性，会导致线粒体膜电位荧光染料TMRM被排出。本文介绍了一种在维拉帕米（一种外排泵抑制剂）存在的情况下，使用TMRM准确测定HSPCs中线粒体膜电位的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
由于细胞代谢是造血干细胞（HSC）自我更新的关键调控因素，HSC 研究人员已广泛研究了线粒体在造血稳态中的多种作用。线粒体的活性水平可通过其膜电位（ΔΨm）来反映，而膜电位可利用细胞通透性的阳离子染料（如 TMRM（四甲基罗丹明甲酯））进行检测。然而，外排泵将这些染料从细胞中排出的能力可能限制其应用效果。这种测量偏差在评估 HSC 时尤为关键，因为异源物质转运蛋白在 HSC 中的表达水平和活性高于分化细胞。本文介绍了一种利用外排泵抑制剂维拉帕米（Verapamil）准确测量骨髓中多个细胞群 ΔΨm 的实验方案。结果显示，抑制外排泵活性可提高造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的 TMRM 荧光强度，而在成熟细胞组分中该强度则相对保持不变。这凸显了在使用依赖 ΔΨm 的染料时，必须密切关注染料外排活性的重要性；本方案通过文字描述与图示展示，可用于准确比较骨髓内不同细胞群之间，或不同实验模型中同一细胞群的 ΔΨm 水平。
引言
造血干细胞（HSCs）具有自我更新能力、多向分化潜能，并能产生血液中的所有细胞类型1,2。细胞代谢与转录因子、内在信号及微环境共同，是调控HSC维持的关键因素3,4,5。因此，线粒体功能和质量的恰当调控对HSC的维持至关重要6,7。
线粒体膜电位（ΔΨm）是评估线粒体功能的关键参数，因为它直接反映了线粒体的功能状态，这种功能源于电子传递链中质子泵活动与F1/FO ATP合酶介导的质子回流之间的平衡。这两种过程均是氧依赖性ADP磷酸化生成ATP所必需的，其活性取决于基因表达和底物的可利用性8,9。利用线粒体区室的电负性特性，已开发出多种电位敏感性染料用于检测ΔΨm。其中一种是高氯酸四甲基罗丹明甲酯（TMRM），该染料已被广泛用于通过流式细胞术在多种细胞中测定ΔΨm10....
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方案
本文所述所有方法均已获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 溶液的配制
- 染色缓冲液（磷酸盐缓冲液 (PBS) + 2% 胎牛血清 (FBS)）：在500 mL无菌PBS溶液中加入10 mL FBS。
注意：该溶液可在无菌条件下于4 °C保存至少一个月。开始后续操作前，将一份该溶液（50 mL）置于冰上预冷。 - ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液：在开始实验前，将一份ACK裂解缓冲液（1 mL）置于冰上预冷。
注意：如需配制相同成分的非商用缓冲液，可将8.02 g NH4Cl、1 g KHCO3 和37.2 mg Na2EDTA 溶解于1 L H2O中，调节pH至7.2–7.4。可在室温下保存长达6个月。 - 培养基：在无血清培养基中加入50 ng/mL干细胞因子 (SCF) 和50 ng/mL血小板生成素 (TPO)，用于造血细胞的培养与扩增（推荐的商用培养基见材料表）。
- TMRM储存液：将5 μg TMRM粉末溶于10 mL乙醇中，配制成1 μM的TMRM溶液。避光保存于-20 °C。
- 维拉帕米储存液：将24 mg维拉帕米....
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结果
上述方案可轻松从小鼠模型中分离骨髓单个核细胞。图1总结了该方案的主要步骤：骨骼分离、骨髓冲洗、红细胞裂解，以及抗体染色后进行TMRM染色，以检测特定造血细胞群体中的线粒体膜电位。
骨髓单个核细胞（BM-MNCs）包含多种细胞群体，其中包括造血干细胞（HSCs）。本方案中所用的抗体混合物已广泛用于纯化造血干细胞（CD34− 和 CD34+）、多能祖细胞（MPPs）、Lin− 以及 Lin+ 细胞21。分离这些细胞亚群的设门策略如图2所示。
在确定目标细胞群后，评估TMRM荧光强度，其信号应呈现明亮状态。强烈推荐在无血清扩增培养基（SFEM）中进行TMRM染色，因为在PBS + 2% FBS中染色可能导致HSPC中TMRM信号特征发生改变（
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讨论
线粒体膜电位的测量是分析和评估线粒体功能的核心方法，而线粒体对细胞的代谢状态至关重要。本文介绍了一种利用TMRM染色法分析ΔΨm的实验方案。TMRM是一种可穿透细胞膜的荧光染料，能够因ΔΨm的存在而在具有活性的线粒体中富集，其在细胞外、胞质和线粒体各组分间的分布保持动态平衡10。该方案可适用于多种染料，包括四甲基罗丹明乙酯（TMRE）和JC-1。合适的染色条件对于获得准确结果至关重要，这些条件包括：避免光照、适当的孵育时间、维持恒定温度（37 °C）以及控制细胞外染料浓度。当TMRM染料尚未达到完全平衡时，在流式细胞术的数据采集过程中可能会检测到染色强度的意外变化。因此，建议TMRM的染色时间应为1小时，而非某些TMRM产品说明书中提到的30分钟。此外，建议在5分钟内至少连续采集样本两次，以评估染料信号的稳定性。
该实验方案的另一个关键步骤是抗体与染料之间高效的颜色匹配。造血细胞群体可通过流式细胞术，利用已确立的表面标志物进行检测21。本文所述的设门策略（
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢伊藤实验室的所有成员，特别是 K Ito 和 H Sato，以及爱因斯坦干细胞研究所提供的意见，同时感谢爱因斯坦流式细胞术与分析成像核心设施（由美国国家癌症研究所资助项目 P30 CA013330 支持）在实验实施过程中提供的帮助。K.I. 的研究得到了美国国立卫生研究院资助项目（R01DK98263、R01DK115577 和 R01DK100689）以及纽约州卫生局作为爱因斯坦单细胞基因组学/表观基因组学核心负责人（C029154）的支持。K.I. Ito 是白血病与淋巴瘤学会的研究学者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ACK 裂解缓冲液 | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-生物素 | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-生物素 | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-生物素 | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-生物素 | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-生物素 | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-生物素 | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-生物素 | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| 环孢素 H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI 溶液 (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-生物素 | Biolegend | 108404 | |
| IgM-生物素 | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-生物素 | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-生物素 | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF 小鼠 | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM 培养基 | STEMCELL technologies | 9605 | |
| 链霉亲和素-太平洋蓝 | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-生物素 | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| 盐酸维拉帕米 | Millipore Sigma | V4629-1G |
参考文献
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J.
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重印与许可
