Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Abstract

Allojeneik kemik iliği transplantasyonu (KNOT), tümörlerin kökünü kurutmak için greft-versus-lösemi (GVL) etkisine bağlı hematolojik maligniteler için etkili bir tedavi yöntemidir. Ancak, uygulama greft-versus-host hastalığı gelişimi ile sınırlıdır (GVHD), BMT önemli bir komplikasyon. GVHD donör greftlerinde T-hücreleri alıcı hücreler tarafından ifade alloantijen tanımak ve alıcı sağlıklı dokulara karşı istenmeyen immünolojik saldırılar monte uyarılır. Böylece, geleneksel tedaviler donör T-hücre alloreactivity bastırmak için tasarlanmıştır. Ancak, bu yaklaşımlar gvl etkisini önemli ölçüde bozar, böylece alıcının hayatta kalması iyileştirilmez. Terapötik yaklaşımların BMT, GVL ve GVHD üzerindeki etkilerini anlamak bu nedenle önemlidir. Donör T-hücrelerini uyarmak için antijen sunum ve sitokin salgılayıcı kapasiteleri nedeniyle, alıcı dendritik hücreler (DCs) GVHD indüksiyonönemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, alıcı DC'leri hedefleme gvhd kontrol etmek için potansiyel bir yaklaşım haline gelir. Bu çalışma, ev sahibi DC'lerin transplantasyon sonrası GVH ve GVL yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için yeni bir BMT platformunun açıklamasını sağlar. Ayrıca transplantasyon sonrası GVHD ve GVL biyolojisini incelemek için etkili bir BMT modeli sunulmaktadır.

Introduction

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (KT) hematolojik malignitelerin tedavisinde etkili bir tedavidir1,2 greft-versus-lösemi (GVL) etkisi ile3. Ancak, donör lenfositler her zaman alıcı dokulara karşı istenmeyen immünolojik ataklar monte, greft-versus-host hastalığı olarak adlandırılan bir süreç (GVHD)4.

GVHD Murine modelleri GVHD ve GVLyanıtı5 biyolojisini incelemek için etkili bir araçtır. Fareler uygun maliyetli bir araştırma hayvan modelidir. Onlar küçük ve verimli moleküller ve biyolojik geliştirmeninerken aşamalarında ile dosed 6 . Onlar genetik olarak iyi tanımlanmış, çünkü fareler genetik manipülasyon çalışmaları için ideal araştırma hayvanlar, hangi biyolojik yollar ve mekanizmaları incelemek için idealdir6. C57BL/6 (H2b) ile BALB/c (H2d)ve FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7gibi birkaç fare majör histouyumluluk kompleksi (MHC) MHC uyumsuzmodelleri iyi kurulmuştur. Bunlar, bireysel hücre tiplerinin, genlerin ve GVHD'yi etkileyen faktörlerin rolünü belirlemek için özellikle değerli modellerdir. C57/BL/6 (H2b)ebeveyn donörlerinden MHC I (B6.C-H2bm1)ve/veya MHC II (B6.C-H2bm12)mutasyonu olan alıcılara yapılan transplantasyon, hem MHC sınıf I'de hem de sınıf II'de bir uyumsuzluk olduğunu ortaya koymuştur. Bu hem CD4+ ve CD8+ T-hücreleri hastalık gelişimi için gerekli olduğunu göstermektedir7,8. GVHD aynı zamanda 'pro-inflamatuar sitokin fırtınası' olarak bilinen inflamatuar bir kaskad yer almaktadır9. Murine modellerinde en sık kullanılan klima yöntemi x-ray veya 137Cs ile toplam vücut ışınlaması (TBI) yöntemidir. Bu alıcının kemik iliği ablasyon yol açar, böylece donör kök hücre engraftment izin ve greft reddini önlemek. Bu donör hücrelere yanıt olarak alıcı T-hücrelerinin çoğalmasını sınırlayarak yapılır. Ayrıca, genetik eşitsizlikler de küçük MHC-uyumsuzluk10bağlıdır hastalık indüksiyon, önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, miyeloablatif ışınlama dozu farklı fare suşlarında değişir (örneğin, BALB/c→C57BL/6).

Donör T-hücrelerinin konak antijen sunan hücreler (AAP' ler) tarafından aktivasyonu GVHD gelişimi için gereklidir. ADC'ler arasında, dendritik hücreler (DCs) en güçlü. Onlar kalıtsal onların üstün antijen alımı nedeniyle GVHD indükleme yeteneğine sahiptirler, T-hücre ko-uyarıcı moleküllerin ekspresyonu, ve patojenik subsets içine T-hücreleri polarize pro-inflamatuar sitokinler üretimi. Alıcı DCs transplantasyon sonrası T-hücre astar ve GVHD indüksiyon kolaylaştırmak için kritik11,12. Buna göre, DCs GVHD tedavisinde ilginç hedefler haline gelmiştir12.

TBI donör hücre engraftment geliştirmek için gereklidir. TBI etkisi nedeniyle alıcı CD'ler aktive edilir ve transplantasyondan sonra kısa bir süre hayattakalır12. Biyolüminesans veya floresan kullanımındaki büyük gelişmelere rağmen, GVHD'de alıcı DC'lerin rolünü incelemek için etkili bir model oluşturmak hala zordur.

Donör T-hücreleri GVL aktivitesi için itici güç olduğundan, t-hücre alloreactivity bastırmak için steroid gibi immünsupresif ilaçlar kullanarak tedavi stratejileri genellikle tümör nüks veyaenfeksiyonneden 13. Bu nedenle, alıcı DC'leri hedeflemek GVL etkisini korurken ve enfeksiyondan kaçınırken GVHD tedavisinde alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.

Kısacası, mevcut çalışma, alıcı DC'lerde farklı sinyal türlerinin GVHD gelişimini ve BMT'den sonra GVL etkisini nasıl düzenlediğini anlamak için bir platform sağlamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deneysel prosedürler, Central Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. GVHD İndüksiyon

NOT: Allojeneik kemik iliği (BM) hücre nakli (adım 1.2) ışınlama dan sonra 24 saat içinde yapılır. Aşağıda açıklanan tüm işlemler steril bir ortamda gerçekleştirilir. Bir doku kültürü başlık prosedürü gerçekleştirin ve filtrelenmiş reaktifler kullanın.

  1. 0. Gün: Alıcı fareleri hazırlayın.
    1. Balb/c arka planda (CD45.2+ H2kd+), alıcı olarak 10−12 haftalık dişi yabani fareler kullanın.
    2. TBI'den önce alıcıları tarttırın ve kulak etiketi. Daha sonra, ışınlama odasına en fazla 11 fare yerleştirin ve ışınlayıcıda saklayın. 10−15 dk boyunca 700 cGy tek bir dozda ışın.
    3. Radyasyona maruz kalanlardaki hayvanları kafeslere geri döndürün ve nakilden önce patojensiz tesislerde barındırın.
      NOT: Alıcıların en az vücut ağırlığı yaklaşık 20 g olmalıdır.
  2. 1. Gün: Donör farelerden T-hücre tükenmiş kemik iliği (TCD-BM) hazırlayın.
    1. CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 fareleri CO2 boğulma ile ötenazi edin ve bilinçsiz olana kadar 2−3 dk bekleyin. Gerekirse ikincil ötenazi olarak servikal çıkığı gerçekleştirin.
    2. Her fareyi temiz bir çalışma tahtasına koyun. % 70 isopropanol ile kürk ve cilt sanitize.
    3. Forseps ve makas kullanarak her iki bacaktan tibia ve femur toplayın. 50 mL konik tüplerde %1 FCS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin (%1 RPMI) içeren buz gibi RPMI'ye koyun. Femur ve tibia kemiklerini, forceps ve makas kullanarak tüm kas dokularını temizleyerek iyice temizleyin. 50 mL konik tüplerden %1 RPMI içeren 92 mm çapındaki Petri kabına femur ve tibia aktarın.
    4. Makas kullanarak, femur veya tibia uçlarını kesti. 50 mL'lik bir tüpü %1 RPMI 1640 orta ile 25 mL doldurun. Bunu, 26 G iğneye bağlı ve %1 RPMI'lik 3 mL'lik bir şırınga yı doldurmak için kullanın. Bu şırıngayı kemiğe takın ve daldırıcıyı iterek kemik iliğini (BM) boşluktan %1 RPMI (~3 mL/kemik) ile toplama tüpüne boşaltın.
    5. Diğer donör farelerden kalan tüm kaval kemiği ve uyluk kemiği için adım 1.2.4'ü tekrarlayın. Tüm toplama tüplerini buzda tut.
    6. Kemik iliği parçalarını 75 μm mesh hücreli süzgeçten geçirerek tek hücreli süspansiyonu yapın. Tek hücreli süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
    7. 4 °C'de 5 dk için 800 x g santrifüj tüpler. Aspire ve supernatant atın. PBS tamponundaki peletin %0.5 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren 20 x 106 hücre/mL'de yeniden askıya alınması. Saflık boyama için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin.
    8. 0,05 μg/106 hücre14 ve 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yat.a 80 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 00 00 00 00 0 25 mL buz gibi PBS ile bir kez yıkayın. 20 x 106/mL'de %0.5 BSA/10% genç tavşan komplemanı/%2 DNase(steril H2O'da 10.000 U/mL) yeniden askıya alın. 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatın ve eskisi gibi 2x yıkayın.
      NOT: T-hücreleri Thy1'e özgü bir mAb kullanılarak tükenir, tüm T-hücreleri tarafından ifade edilen bir protein, ancak diğer lökositler tarafından ifade edilmez.
    9. %0.5 BSA içeren PBS tamponunun 20 mL'lik hücrelerini yeniden askıya alın. Kemik iliği hücrelerini hemositometre kullanarak %1 asetik asit tesviye edin. Hücre saflaştırma sonra akış sitometri tarafından saflık kontrolü için 2 x 106 hücreleri bir aliquot tutun.
      NOT: Bir donör fare normalde yaklaşık 25 x 106 TCD-BM üretir.
    10. Başarılı bir T hücresi tükenmesini onaylamak için akış sitometrisini kullanın. 1 x 106 hücreleri, 1.2.7 (T-hücre tükenmesinden önce) ve 1.2.9 (T-hücre tükenmesinden sonra T-BM) aşağıdaki antikorlarla lekeler: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve α-CD8α (53-6.7).
  3. 1. Gün: Donör farelerden T-hücreleri hazırlayın
    1. CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 yabani tip (WT) fareleri T hücreleri için donör olarak kullanın.
    2. 1.2.1'de açıklandığı gibi C57BL/6 farelerini karbondioksit (CO2)boğulması ile ötenazi.
    3. Farenin kürkünü ve cildini %70 etanol ile iyice temizleyin. Dalakları ve lenf düğümlerini özelleştirin ve şırınga pistonu ve 40 m örgü süzgeçkullanarak splenositlerin tek hücreli süspansiyonuna ayırın. Tüm splenositleri toplamak için süzgeci ve şırınga pistonu %1 RPMI (%1 FBS içeren RPMI media) ile yıkayın.
    4. Hücre süspansiyonuna 800 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. 5 mL ACK lysing tampon (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) ekinden atılmalıdır. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: ACK lysis tampon kırmızı kan hücrelerinin lysing için kullanılır.
    5. Lysis durdurmak için% 1 RPMI 5 mL ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.
    6. Buz gibi manyetik aktive hücre sıralama (MACS) tamponu (%0.5 BSA, PBS'de 2 mM EDTA, pH 7.2) hazırlayın. Kullanmadan önce arabelleği degas edin. 5 mL MACS arabelleğindeki hücre peletlerini yeniden askıya alın.
    7. Splenositleri sayın ve hemositometre ve %1 trippan mavisi kullanarak canlı ve ölü hücreleri kontrol edin. Akış sitometri analizi ile saflaştırma verimini değerlendirmek için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin.
    8. MACS tamponunda 200 x 106/mLkonsantrasyonda splenositleri yeniden askıya alın. 0.03 μL biotin anti-mouse-Ter-119, 0.03 μL biotin anti-mouse-CD11b, 0.03 μL biotin anti-mouse-CD45R ve 0.03 μL biotin anti-mouse-DX5 106 hücre başına ekleyin. 4 °C'de 15 dakika kuluçka.
      NOT: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R ve biotin anti-mouse-DX5 sırasıyla eritrosit, granülositler, B-hücreleri ve NK hücreleri ile reaksiyona kullanıldı. Bu nedenle, bu hücre alt kümeleri aşağıdaki adım15tükenmiş.
    9. Hücre süspansiyonuna 10 mL buz gibi MACS tamponu ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.
    10. MACS arabelleğindeki hücre peletlerini 100 x 106/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Splenosit süspansiyonuna anti-biyotin mikroboncukları (0.22 μL/106 hücre) ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika daha kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonuna 10 mL buz gibi MACS tamponu yla bir kez yıkayın. 4 °C'de 5 dk 800 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı atın.
    11. Manyetik alana manyetik bir ayırma sütunu koyun. 3 mL MACS arabelleği ile sütunu durulayın. Hücre süspansiyonu sütunüzerine bırakın. Yeni bir 15 mL konik tüp içinde, sınırsız, zenginleştirilmiş T-hücrelerinden oluşan akış-through toplamak. MS sütununa 3 mL buz gibi MACS arabelleği ile yıkayın.
      NOT: Yıkama adımlarını gerçekleştirmeden önce sütunun boş olduğundan emin olun.
    12. Hücre süspansiyonuna 800 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. 5 mL MACS arabelleğindeki hücre peletini yeniden askıya alın.
    13. Hücreleri hemositometre kullanarak %1 trippan mavisi olarak sayın. Akış sitometrisi tarafından saflık kontrolü için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin.
      NOT: Bu yöntemle izole edilen dalak T-hücrelerinin ortalama verimi fare başına ~20−25 x 106 hücredir.
    14. Akış sitometrisi ile T-hücre zenginleştirme verimini onaylayın. 1 x 10 6 hücreleri, 1.3.7 (T-hücre tükenmesinden önce) ve 1.3.13 (T-hücre tükenmesinden sonra TCD-BM) basamaklarından korunan 1 x 106 hücreleri aşağıdaki antikorlarla lekeler: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve-α-CD8α (53-6.7).
  4. 1. Gün: Işınlanmış farelere donör T-hücreleri ve TCD-BM enjekte edin.
    1. TCD-BM ve T-hücrelerini 2x PBS ile yıkayın (4 °C'de 5 dk için 800 x g). Enjeksiyon için buz gibi PBS hücreleri resuspend. Hücre konsantrasyonu TCD BM için 20 x 106/mL ve T hücreleri için 4 x 106/mLolarak ayarlayın.
    2. Çift taraflı kuyruk damarlarının görünürlüğünü artırmak için bir ısıtma lambası kullanarak hayvan ısıtın. Gerekirse fareyi bir dizginleyiciye yerleştirin.
    3. % 70 isopropanol kullanarak kuyruk yüzeyini temizleyin. TCD-BM (5 x 106 hücre/fare) t-hücreleri (0,75 x 106 hücre/fare) ile enjekte edin. Şırınganın içine hava sokmamaya dikkat edin.
    4. İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için doğrudan enjeksiyon bölgesine 5−10 s antiseptik bir bez uygulayın.
  5. GVHD'yi 2−80 gün olarak değerlendirin.
    1. Hayvan hayatta kalma takip edin. Cook ve ark.16 tarafından daha önce kurulan skorlama sisteminden uyarlanan GVHD'nin klinik bulgularını ve alıcı farelerin vücut ağırlığını haftada 2 x izleyin. Vücut kilo kaybıhesaplamak için TBI önce belirlenen vücut ağırlığı kullanın.
    2. Her fareyi ayrı ayrı tartın. Puan aşağıdaki gibi kilo kaybı: grade 0 = az% 10; sınıf 1 = %10−%20; grade 2 = %20'den fazla.
    3. Alıcıların duruş işareti puan: grade 0 = hiçbir önsezi; grade 0.5 = hafif önsezi ama yürürken düzer; sınıf 1 = hayvan yürürken kambur kalır; grade 1.5 = hayvan düzleştirmek değil; grade 2.0 = arka ayak larda hayvan standı.
    4. Alıcıların hareketlilik işareti puan: grade 0 = çok aktif; grade 0.5 = naif farelerden daha yavaş; grade 1.0 = sadece dürttüğünde hareket eder; grade 1.5 = dürttüğünde hafif hareket eder; grade 2.0 = dürttüğünde hareket etmez.
    5. Alıcıların cilt puan: grade 0 = hiçbir aşınma, lezyonlar, ya da ölçekleme; grade 0.5 = belirli bir alanda kızarıklık; grade 1 = bir alanda aşınma veya iki alanda hafif aşınma; grade 1.5 = iki veya daha fazla alanda ciddi aşınmalar; grade 2.0 = şiddetli sıyrıklar, çatlama cilt, kurutulmuş kan.
    6. Alıcıların kürk puan: grade 0 = hiçbir anormal işaretler; grade 0.5 = boyun göbek veya ense tarafında ridging, grade 1.0 = karnının veya boyun tarafı nın veya yan sının; grade 1.5 = unkempt mat ve fırfırlı kürk; grade 2.0 = göbek ve sırt üzerinde kötü mat kürk.
    7. Puan alıcıların ishal: grade 0 = hiçbir ishal; grade 0.5 = hafif ve yumuşak dışkı; grade 1.0 = hafif (sarı dışkı); grade 1.5 = orta (biraz kan ile sarı dışkı); grade 2 = şiddetli (açık sarı ve kanlı dışkı, "kurutulmuş kek dışkı" anal alanda görünür).

2. Kotransplantasyon Modeli

  1. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücreler (BM-DCs) oluşturun.
    1. 1.2.3−1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi B6 arka planüzerindeki WT veya faktör B (fB)-/- farelerin uyluk ve tiyyanlarından kemik iliği izole edin. Hücreleri 800 x g'de 5 dk döndürün.
    2. Kırmızı kan hücresi lisisi için 5 mL'lik ACK lysing tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 5 dk için 800 x g'de lisi ve santrifüjü durdurmak için hücre süspansiyonuna %1 RPMI'nin 10 mL'sini ekleyin. Supernatant atın.
    3. Hücre peletlerini 10 mL kültür medyasında (RPMI 1460 %10 FBS içeren, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 50 mM β-mercaptoetanol) yeniden askıya alın ve 2 x 106 hücre/mL'nin son konsantrasyonuna uyacak şekilde ayarlayın.
    4. Hücre süspansiyonuna 20 ng/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ekleyin. Kültür 100 x 15 mm Petri yemekleri 37 °C 5% CO2 6 gün boyunca kemik iliği hücreleri.
    5. Devam eden kültür ortamının yarısını (yaklaşık 5 mL) 3.
    6. Kültür ortamını 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın. Kemik iliği kültür yemeklerinden yaklaşık 5 mL medya toplayın. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın. 40 ng/mL GM-CSF içeren 5 mL kültür medyasında hücre peletini yeniden askıya alın.
    7. BM-DC'leri olgunlaştırmak için kültürün 6.6
    8. Olgunlaşmış BM-DC'leri toplayın: Petri yemeklerinden CD'leri yumuşak bir şekilde kazımak için hücre kaldırıcıları kullanın. Tüm hücre süspansiyonlarını 50 mL konik tüplerde toplayın. Santrifüj 800 x g, 4 °C'de 5 dk. Supernatant atın. Hücre peletlerini 50 mL buz gibi PBS ile 3 x yıkayın. Akış sitometrisi ile immünolojik fenotip analizi için yaklaşık 2 x 106 BM-DC kaydedin.
  2. BMT (DC-cotransplanting BmT) dendritik hücre ko-transplantasyon gerçekleştirin.
    NOT: T-hücreleri ve BM hücreleri için donör olarak FVB (H2kq)fareler kullanın. 1.100 cGy (2 doz, 3 saat aralık) bir dozda B6 Ly5.1 alıcı fareler ışın. 1.1. adımdaki ayrıntılara bakın.
    1. BM'yi FVB donör farelerin uyluk kemiğinden ve tibiaslarından ayırın. 1.2.3−1.2.10 adımlarında ayrıntılara bakın.
      NOT: Bu modelde TCD-BM yerine toplam izole kemik iliği kullanın.
    2. FVB donör farelerin dalak ve lenf düğümlerinden T-hücrelerini arındırın. 1.3.1-1.3.13 adımlarında ayrıntılara bakın.
    3. Deney kursunun 0. gününde BM-D'lerle (2 x 106/fare) BM(5 x 106/fare), T-hücrelerini (0,5 x 106/fare) enjekte edin.
    4. Transplantasyondan sonraki 3.
      1. Alıcıların gözlerinden kan toplayın.
      2. CD45.1/Ly5.1 B6 farelerini %3 isofluran emdirerek anestezi edin. Bir parmak sıkışmayanıt eksikliği ile anestezi derinliği ni kontrol edin.
      3. Burun düzleminden 30−45° açıyla caudally yönlendirilen gözün medial kanthusuna steril cam pipet tüpü yerleştirin. Tüpü hafifçe döndürürken basınç uygulayın.
      4. Kanı 10 μL heparin içeren steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine bırakın. 5 mL cam akış tüplerine 50 μL kan aktarın.
      5. 2 mL ACK lysing arabelleği ekleyin. 45 dk. 2 mL FACS boyama tamponu ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.
      6. Uygun akış boyama antikorları içeren 200 μL FACS tamponu içeren hücre peletlerini yeniden askıya alın (canlı/ölüm sarısı, α-H-2Kb,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c ve α-MHCII). Karanlıkta 4 °C'de 15 dakika kuluçka. 1 mL FACS arabellek ile 2x yıkayın. 200 μL FACS tampon hücre peletleri resuspend ve akış sitometri ile analiz yapmak.

3. BMT GVHD /GVL Modelleri

  1. GVHD/GVL indüksiyonu gerçekleştirin.
    1. Kültür luciferase RPMI kültür medyada A20 B hücreli lenfoma transduced.
    2. 700 cGy (tek doz) de BALB / c arka plan WT veya Ly5.1 alıcı ışın. 1.1. adımdaki ayrıntılara bakın.
    3. TCD-BM'yi B6'nın uyluk ve tiyyanlarından ayırın. Ly5.1 donör fareler. 1.2.1−1.2.10 adımlarında ayrıntılara bakın.
    4. C57BL/6 donör farelerin dalak ve lenf düğümlerinden T-hücrelerini arındırın. 1.3.1−1.3.15 adımlarında ayrıntılara bakın.
    5. A20 lenfoma 2x'i 25 mL PBS ile yıkayın. Hücre peletlerini 10 mL buz gibi PBS'de yeniden askıya alın. Bir hücre süspansiyon aliquot alın (10 μL) ve% 1 trypan mavi ve hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Hücre konsantrasyonu 20.000 hücre/mL olarak ayarlayın.
    6. TCD-BM (5 x 106/fare) T-hücreleri (0,75 x 106/fare) ve A20 lenfoma (5.000 hücre/fare) ile enjekte edin.
    7. Deneysel kurs sırasında alıcının sağkalımını, GVHD klinik bulgularını ve vücut kilo kaybını takip edin. 1.5 adımdaki ayrıntılara bakın.
  2. Biyolüminesans görüntüleme yapın.
    1. Alıcıya 4 mg D-luciferin enjekte ederek, nakledilen alıcıdaki tümör büyümesini izleyin. Luciferin luciferase ile reaksiyona emin olmak için 5 dakika kuluçka.
    2. Bir biyolüminesans görüntüleyici odasında% 3 izofluran kullanarak fare anestezi ve alan D ve 1 dk pozlama süresi 5 dakika için alıcılar görüntü.
    3. Görüntü analiz yazılımLarını kullanarak verileri analiz edin. En iyi sonuçlar için sözde renkli görüntülerin ölçeğini değiştirin.
      NOT: Tüm resimler deneyler arasında aynı ölçekte olmalıdır.
    4. İlgi bölgelerini belirlemek ve her ilgi bölgesinden yayılan akısı (fotonlar/ler) hesaplayarak sinyal yoğunluğunu ölçmek için görüntü analiz yazılımını kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Majör MHC uyumsuz B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir (Şekil 2). Cooke ve ark.16 tarafından daha önce tespit edilen altı GVHD klinik bulgunun tümü WT-B6 T-hücreleri ile nakledilen alıcılarda meydana gelmekte, ancak gvhd-negatif grubunu temsil eden BM ile nakledilen alıcılarda (adım 1.5) yer almıyordu. Bu modelde GVHD gelişiminde iki aşama vardır. İlk olarak, şiddeti zirve yaklaşık 11 gün sonra transplantasyon, klinik skorları ve 16 güne kadar vücut ağırlığı kurtarma bir azalma izledi. Bu aşamada, ışınlanmaya bağlı inflamasyon ve engreftment sendromu gibi çeşitli mekanizmalar hastalık patojenitesini ve GVHD'yi yönlendirir. Alıcılar organ naklinden yaklaşık 30−40 gün sonra GVHD'ye eşit olarak yenik düşerler.

BM'nin en az %85'i DC'lere ayrılmıştır (Şekil 3A). İlginçtir ki, fB ile transplantasyon-/- DC'ler alıcı sağkalım ını ve GVHD klinik skorunu iyileştirmiştir(Şekil 3B,C). FB-/- DC'lerin düşük MHCII ekspresyonu ve azaltılmış ko-uyarıcı reseptör ekspresyonu17ile gösterilen daha az antijen ekibe sahip olduğu göz önüne alındığında, bmt sonrası GVHD gelişiminde alıcı CC'lerde çeşitli sinyal veya hedefleri incelemek için ko-transplantasyon protokolü yeterli olabilir.

Zenginleştirmeden sonra T-hücresi saflığı %90 idi(Şekil 4A). Luciferase'e bağlı A20 B hücreli lenfoma canlı hayvanlarda tümör büyümesinin izlenmesini sağlar (Şekil 4B). Bu modelde, alıcılar herhangi bir sinyal ve yüksek GVHD klinik skoru olmadan öldü, onlar GVHD öldü sonucuna vardı. Bm tek başına alınan tüm WT BALB/c alıcıları artı A20 tümör nüksünden ölmüştür(Şekil 3B). Buna karşılık, eğer hayvan daha yüksek sinyal yoğunluğundan öldüyse, tümör nüksünden öldüğü sonucuna varılmıştır. Şekil 3 Figure 3B'degösterildiği gibi, ACC1fl/fl B6 donörden (ACC1+/+ T-hücreleri) BM ve T-hücreleri ile nakledilen WT BALB/c alıcıları GVHD'den ölmüştür. Eğer hayvanlar hastalık sinyalleri ile öldülerse, GVHD'den öldükleri ve tümör nüksettikleri sonucuna varıldı. ACC1fl/fl x CD4 cre B6 donörden (ACC1-/- T-hücreleri) BM ve T-hücreleri alan hayvanlar hem GVHD hem de tümör nüksünden öldüler(Şekil 3B). Hayvanlar daha sonraki bir zaman noktasında görüntülenecek kafese geri yerleştirilebilir veya ex vivo görüntüleme için ötenazi yapılabilir. Yazılımı kullanarak, hayvandaki tümör kütlesi de ayrı ayrı analiz edilebilir (Şekil 3B).

Figure 1
Şekil 1: BmT prosedürünün şematik gösterimi. (A) MHC uyumsuz B6→BALB/c BMT modeli için şema. (B) DC eş nakli FVB→B6 modeli için şema. (C) B6→BALB/c GVHD/GVL modeli için şema. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Majör MHC uyumsuz B6→BALB/c GVHD modeli. BALB/c fareler ilerlemiştir ve sadece 5 x 106 BM veya 0.75 x 106 T-hücreleri ile nakledildi. (A) Hayatta kalma verileri, (B) vücut kilo kaybı ve (C) BM alıcılarının klinik skor verileri tek başına veya T-hücreleri ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: DC co-transplanting HCT modeli. BM, WT ve fB-/- B6 farelerinden izole edildi ve GM-CSF ile kültürlendirilerek DC'lere farklılaştırılmıştır. (A) CD11c ve MHCII ile boyama ile dc'lerin saflığı akış sitometrisi ile incelendi. Ölümcül ışınlanmış B6 alıcıları, FVB donörlerinden BM (3 x 106/fare) artı saflaştırılmış T-hücreleri (1 x 106/fare) ile nakledildi. Alıcılar ayrıca transplantasyon gününde 2 x 106 WT veya fB-/- B6 BM-DCs hücreleri aldı. Sağkalım (B) ve klinik skor(C)gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Majör-MHC uyumsuz B6→BALB/c GVHD/GVL modeli. WT BALB/c alıcıları Tek başına TCD-BM (5 x 106/fare) veya ACC1+/+ T-hücreleri veya ACC1+/+ T-hücreleri (1 x 106/fare) B6 arka plan donör farelerden izole edilmiş olarak nakledildi. Ayrıca alıcılar nakil sırasında 2 x 103 A20-luc aldı. T-hücre saflığı canlı/ölüm sarısı, CD3, CD4 ve CD8 akış antikorları(A)ile boyama yoluyla akış sitometrisi ile incelendi. Alıcılar tüm vücut biyolüminesans görüntüleme (BLI)(B)ile belirlenen tümör büyümesi için izlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Belirli bir kişiye uygun kök hücre kullanımı gelişmiş ve dirençli kanserlerin tedavisinde etkili bir yaklaşımdır18. Küçük molekül ilaç, ancak, uzun kişiselleştirilmiş kanser tedavisinin birincil odak kalmıştır. Öte yandan, hücresel tedavide donör ve konak arasındaki etkileşimlerin çok sayıda kararlı tedavi sonuçlarını etkileyebilir, BMT sonra GVHD gelişimi gibi1.

BmT'nin MHC'li büyük fare modelleri GVHD'nin biyolojisini anlamada ve tedavide ilaçların etkinliğini test etmede değerli bir araçtır. Bunlardan, C57BL/6 (H2b) BALB/c (H2d)ve FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)iyi kurulmuş modeller5,7. Bu modeller, bağırsak toksisitesini azaltmak için 3-8 saatlik aralıklarla gerekli olan tek doz (BALB/c) veya fraksiyonel doz (C57BL/6) olarak miyeloablatif radyasyon koşullandırmasınıiçerir. Her iki model de HEM CD8+ hem de CD4+ T hücrelerine bağlıdır. Bu modellerde GVHD şiddeti ve sağkalım ölçülen başlıca sonuçlardır ve nakledilen alıcının tutarlı hızlı kinetik ve %100 penetrasyona sahiptir. T-hücre göçünü ve genişlemesini izlemek için, luciferase eforlu donör farelerden T-hücreleri in vivobioluminescence imaging19için kullanılmalıdır. Ancak, yapılan KİT'lerin %90'ı MHC ile eşleşse de, B6-BALB/c modeli klinik duruma mükemmel benzemez. MHC ve minör histokompatibilite antijenlerinin (miHAs) keşfi BMT10alanının ilerlemesine önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Minör MHC uyumsuz GVHD fare modelleri hasta GVHD20'yidaha yakından taklit edecektir. Donör hücre engraftment indüklemek için klima yoğunluğu doku hasarına neden olur ve GVHD sonucu etkileyebilir21. Murine modellerinde klima rejimleri genellikle klinik ortamlarda kemoterapi aksine TBI içerir22,23. Bu nedenle, bir immünsupresif kemoterapi modeli kliniklerde azaltılmış koşullu yoğunluğu taklit etmek için kullanılmıştır. Fare modeli C57BL/6 (H2b) balb/c (H2d)idi ve nakledilen alıcılar GVHD24ile ilişkili klinik ve histolojik semptomlar geliştirdiler.

Ortak nakledilen protokolün potansiyel avantajı, özellikle CD11c tükenmiş farelere bağlı kalmadan alıcı DC'lerin rolünü test etmektir. BM-DC nesli ex vivo yapıldığından, bu protokol sadece kültür koşullarını değiştirerek Makrofajlar veya nötrofiller gibi diğer hücre türlerinin rolünü test etmek için de uygulanabilir. CD45.1+ B6 farelerinin alıcı olarak kullanılması, araştırmacıların BM-DC'leri (CD45.2+ CD11c+ )alıcı DC'lerden (CD45.1+ CD11c+ +) akış analiziyle ayırt etmesine olanak tanır. Ekstrem itol üretilen ve nakledilen alıcılara kabul edilen esnek hücre sayısı, eş transplantasyon protokolünün bir diğer avantajıdır. Ayrıca, ex vivo kültür bize GVHD kontrol etmek için potansiyel ilaçlar tarama sağlar.

Vivo tümör desenleri izlemek için yeteneği bir ilaç GVL aktivitesini etkileyebilir olup olmadığını test etme potansiyeline sahip güçlü bir araçtır. Bu GVHD/GVL modeli kullanılarak canlı hayvanlarda tümör progresyonu ve metastazı izlenebilir16. Ayrıca, bu ayar birden fazla kanserde GVL etkisini test etmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yok.

Acknowledgments

Bu çalışma University of Central Florida College of Medicine start-up hibe (HN), Pittsburgh Üniversitesi Tıp Merkezi Hillman Kanser Merkezi start-up hibe (HL), Amerika Birleşik Devletleri NIH Grant #1P20CA210300-01 ve Vietnam Sağlık Bakanlığı Hibe #4694/QD-BYT (PTH için) tarafından desteklenir. Güney Carolina Tıp Üniversitesi'nden Dr. Xue-zhong Yu'ya çalışma için malzeme sağladığı için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 157 hematopoetik kök hücre nakli kemik iliği nakli greft-versus-host hastalığı greft-versus-lösemi dendritik hücreler dendritik hücre ko-transplantasyonu
Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, H. D., Huong, P. T.,… More

Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter