Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

Anton Dvorzhak; Rosemarie Grantyn

doi:10.3791/60113

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Articolo metodologico

Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

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DOI:

10.3791/60113

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11 marzo 2020

Anton Dvorzhak¹ , Rosemarie Grantyn¹

¹Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per valutare l'equilibrio tra il rilascio del glutammato e l'autorizzazione alle singole sinapsi glutamatergiche corticosterogiche in fette acute di topi adulti. Questo protocollo utilizza il sensore fluorescente iGlu_u per il rilevamento del glutammato, una telecamera sCMOS per l'acquisizione del segnale e un dispositivo per l'illuminazione laser focale.

Abstract

Le sinapsi sono unità funzionali altamente compartimentate che operano in modo indipendente l'una sull'altra. Nella malattia di Huntington (HD) e in altri disturbi neurodegenerativi, questa indipendenza potrebbe essere compromessa a causa dell'insufficiente eliminazione del glutammato e dei conseguenti effetti di fuoriuscita e fuoriuscita. Una copertura astrocitica alterata dei terminali pressinaptici e/o delle spine dendritiche, nonché una dimensione ridotta degli ammassi trasportatori di glutammato nei siti di rilascio del glutammato sono state implicate nella patogenesi delle malattie che si sono manifestate sintomi di dis-ipercinesi. Tuttavia, i meccanismi che portano alla disfunzione delle sinapsi glutamategiche nella MH non sono ben compresi. Migliorando e applicando l'imaging a sinapsi abbiamo ottenuto dati che gettano nuova luce sui meccanismi che impediscono l'avvio dei movimenti. Qui, descriviamo gli elementi principali di un approccio relativamente poco costoso per ottenere una risoluzione a sinapsi singola utilizzando il nuovo sensore di glutammato ultraveloce codificato geneticamente iGlu_u, ottica a campo largo, una telecamera scientifica CMOS (sCMOS), un laser da 473 nm e un sistema di posizionamento laser per valutare lo stato delle sinapsi corticostriatali in fette acute da topi sani o malati appropriati. I transienti glutammati sono stati costruiti da uno o più pixel per ottenere stime del rilascio di i) glutammato in base all'elevazione massima della concentrazione di glutammato [Glu] accanto alla zona attiva e ii) assorbimento del glutammato come riflesso nella costante temporale di decadimento (TauD) del perissitico [Glu]. Le differenze nella dimensione dell'bouton a riposo e nei modelli contrastanti di plasticità a breve termine servivano come criteri per l'identificazione dei terminali corticostalati come appartenenti al percorso intratelencephalico (IT) o al tratto piramidale (PT). Utilizzando questi metodi, abbiamo scoperto che nei topi MH sintomatici il 40% delle sinapsi corticostriatali di tipo PT mostrava una scarsa distanza del glutammato, suggerendo che queste sinapsi potrebbero essere a rischio di danni da eccitotossici. I risultati sottolineano l'utilità del TauD come biomarcatore delle sinapsi disfunzionali nei topi di Huntington con un fenotipo iponetetico.

Introduzione

L'impatto relativo di ogni terminale sinaptico appartenente a una "connessione unitaria" (cioè la connessione tra due cellule nervose) è tipicamente valutato dalla sua influenza sul segmento iniziale del neurone post-sinaptico¹^,². Le registrazioni somatiche e/o dendritiche dei neuroni post-sinaptici rappresentano le più comuni e, fino ad ora, anche i mezzi più produttivi per chiarire l'elaborazione delle informazioni sotto una prospettiva top-down o verticale³^,⁴^,⁵. Tuttavia, la presenza di astrociti con i loro territo....